4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y分化的研究

吴 菲，姜 玲，方 明，陈飞虎，葛金芳

(1．安徽省立医院药剂科，安徽 合肥 230001;2．安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032)

神经母细胞瘤SH-SY5Y，常常发病于小孩，临床中发现部分患者的肿瘤可以进一步分化成熟，甚至自主消失，因此被称为是诱导分化的标准模型。全反式维甲酸(ATRA)是一类经典的细胞诱导分化剂，可在体外诱导神经母细胞瘤分化成熟［1]，不过因为它不易溶于水、不良反应多等多种原因，它的深层次研究也被诸多的因素局限。在实验前期，我们通过改造它的极性基团，合成出一系列新型的维甲酸衍生物［2]，其中一种衍生物ATPR在抑制肿瘤细胞株增殖以及诱导分化上有着极强的生物学活性［3－4]。本研究通过观察 SH-SY5Y 在 ATPR 作用前后增殖以及分化的变化情况，并同步观察RARβ mRNA的表达，研究它的相关分子作用机制。

1 材料与方法

1．1 细胞株材料及主要试剂 细胞株由安徽医科大学临床药理实验室馈赠。主要试剂:DMEM培养液来源于Hyclone公司;小牛血清来源于郑州九龙生物制品有限公司;青霉素购自杭州民生药业有限公司;链霉素购自上海源叶生物科技有限公司;ATRA、二甲基亚砜、MTT、溴化乙锭、核糖核酸酶、碘化丙啶(PI)购自Sigma公司;鼠抗人NSE抗体购自北京博奥森生物科技有限公司;免疫组化二抗试剂盒购自上海金标生物科技有限公司;PCR逆转录试剂盒和扩增试剂盒均为Promage公司产品。

1．2 细胞分组及培养 SH-SY5Y在37℃、5%CO2浓度的培养箱环境中培养。主要分组为:溶剂对照组(含0．05%无水乙醇)，空白对照组(加入等体积DMEM 培养基)，ATPR 组(10－9～10－4mol·L－1)，维甲酸阳性对照组(10－5mol·L－1)。

1．3 MTT法检测抑制率 于96孔培养板中接种每毫升1×104个浓度的细胞。72 h培养之后，向其添加20μLMTT，继续培养4 h，除去上层清液，并于每孔中添加150μL的DMSO，混合均匀，置于酶联免疫检测仪上用490 nm的波长测定，并用试剂对照组进行校零，每组设置5个复孔，重复3次实验，得到数据，取平均值。

1．4 细胞形态学观察 六孔板中每毫升分别接种1×104个细胞，细胞贴壁后用 ATPR(10－9～10－5mol·L－1)、阳性对照药 ATRA 10－5mol·L－1、等体积的DMEM的空白对照以及含0．05%无水乙醇的溶剂对照组加在每个孔内，于10%FCS的DMEM培养体系中培育。72 h后，收集玻片，甲醛溶液固，染液染色，运用显微镜查看相关细胞的形态，并进行拍照记录。

1．5 细胞分化的检测 在六孔板中每毫升分别接种1×104个细胞，给药方法同“1．4”项下，72 h后，于37℃的PBS中漂洗，在4℃环境下用多聚甲醛固定20 min，再次漂洗，加入3%H2O2在室温中避光反应10 min，充分洗涤，随后在湿盒中将BSA添加于盖玻片上，继续反应30 min，将1∶400比例稀释后的糖分解烯醇酶－抗作用液滴加至各组盖玻片上，37℃培养1 h，PBS振荡清洗。用相应的二抗(IgG/Bio)在常温中反应30 min至1 h，振荡清洗，滴加链霉卵白素(SABC)，常温培养20～30 min，PBS漂洗3次，最后用DAB显色5～10 min，蒸馏水漂洗，乙醇脱水，二甲苯进行透过操作，使用中性树脂密封，置于显微镜下进行查看，并拍照留存。实验过程中以2%BSA代替一抗作为阴性对照。

1．6 细胞DNA倍体分析 细胞培养以及给药同“1．4”，用PBS清洗2次，70%冰乙醇 －20℃冰箱固定过夜的方法处理收集到的细胞，细胞离心弃上层清液，并对所剩物用PI 100 mg·L－1以及RNase 50 mg·L－1，在4℃避光环境下染色30 min。采用流式细胞仪并利用modfitLT分析软件对3×104以上细胞进行周期分析。

1．7 RT-PCR 根据实验的需要，设置分组为:加有等量体积的DMEM的空白对照组、加有0．05%无水乙醇的溶剂对照组、加有 ATRA 10－5mol·L－1的阳性对照组以及加有 ATPR 10－5mol·L－1的实验组。反应3 d后采集细胞，进而检测ATPR对细胞中的RARβ的效果。PCR反应参数:94℃预变性5 min，变性 40 s，50 ℃ (RARβ)、56 ℃(GAPDH)，退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环后72℃延伸10 min。进行3次实验，并用其结果平均值进行分析。

1．8 统计分析 利用SPSS 13．0软件进行数据统计与分析，其中数据都采用均数±标准差(x±s)表示，多组资料之间的比较采用单因素方差分析，多组之间两两比较采用 LSD-t检验的方法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 ATPR在细胞增殖中的影响 不同浓度的ATPR作用细胞72 h后，我们发现ATPR能抑制细胞的增殖，其中，10－4mol·L－1抑制效应最明显，最大抑制率达79．3%。和空白组相比，溶剂对照组A490变化不明显，进一步证明细胞增殖变化的差异受无水乙醇溶剂的影响较小，见表1。

表1 ATPR对SH-SY5Y细胞增殖的影响

2．2 细胞形态观察 SH-SY5Y反应时间72 h于吉姆萨染料染色后，在倒置显微镜下观测:空白组细胞大部分都是呈小梭形，部分呈泪滴形、三角形状。ATPR实验组可以发现细胞慢慢形成相似于树突、轴突的神经突出，细胞整体的形状也逐步转变为近成熟的类多边形态的神经节细胞。随药物浓度的增加，细胞形态的改变越明显，其中，10－5mol·L－1的浓度最显著(图1)。

2．3 分化指标的检测 我们通过免疫学检测，发现NSE表达发生变化，对照组反应产物为分布不均匀的浅棕色细小颗粒，显色几乎呈阴性。而使用药物72 h后，免疫反应显色由阴性转变成阳性，产物变成深棕色，大部分存在于细胞质当中，近核位置分布偏多，在细胞核的内部同样存在大小不一的细小产物。同时检测发现，增大药物浓度，神经元特异性烯醇化酶表达增多，当药物浓度达到10－5mo·L－1时，表现最明显(图2)。

图1 不同浓度ATPR作用于SH-SY5Y细胞72 h形态学变化(400×)

图2 不同浓度ATPR作用于SH-SY5Y细胞NSE的影响

2．4 细胞DNA倍体变化 药物作用SH-SY5Y细胞72 h后，与空白组相比，我们发现 ATPR 10－5、10－6mol·L－1G1期细胞同步上升，所占的百分比也有明显的提升，相应的差异符合统计学要求(P＜0．01)，ATPR 10－5mol·L－1S 期的细胞相对减少，相应的差异符合统计学要求(P＜0．01)，此外，G2/M期细胞基本不变，细胞周期进程受到影响，并且在G0/G1期停留。详细情况如图3所示。

2．5 ATPR对SH-SY5Y细胞中RARβ的影响

图3 不同浓度ATPR对SH-SY5Y细胞周期的影响

ATPR(10－5mol·L－1)作用 72 h 后，SH-SY5Y细胞的RARβmRNA表达量增加，加药组与对照组之间的差异显著(P＜0．05)。

3 讨论

ATRA是具有代表性的细胞分化诱导剂，对细胞诸多方面有着很好的调节作用［5－6]，不过它的最低中毒剂量较低，容易产生中毒反应，因此，越来越多的合成化学家希望能找到一种优良的衍生物。本实验研究新合成的衍生物——ATPR对肿瘤细胞株SH-SY5Y的影响，通过MTT检测发现，不同浓度的ATPR对SH-SY5Y细胞具有不同程度的抑制作用，本实验中选取的最大药物浓度为10－4mol·L－1，结果发现细胞出现皱缩、凋亡，推测此时药物对细胞的抑制主要表现为细胞毒作用，而在10－5mol·L－1时，诱导分化作用占主导形态的改变可以客观的表明诱导分化剂的作用效果，是分化的典型标志。吉姆萨染色发现细胞的密集度有了显著的降低，不断有神经突起形成，细胞向成熟的神经节细胞分化，药物的浓度越大，细胞形态的改变也就越大。

图4 ATPR对SH-SY5Y维甲酸受体RARβ的影响

神经元特异性烯醇化酶(NSE)在正常情况下常常分布在神经元和周围神经组织中，甚至是在神经内分泌组织当中也有存在［7]，一般细胞被破坏时释放出来，是针对于神经母细胞瘤的一种高敏感和特异的指示物［8]。通过这次实验，我们发现ATPR对SH-SY5Y细胞中的NSE有显著的上调机制，而在所有的用药浓度中，10－5mol·L－1的药物浓度的作用最为明显。

肿瘤细胞大部分存在于S期，而分化细胞主要存在于G0/G1期，因此细胞周期被阻滞于G0/G1期是细胞分化的重要特征，使用药物后，处于G0/G1期的细胞越来越多，S期的细胞逐渐减少，周期明显停滞在G0/G1期。

大量的研究表明，维甲酸的诱导分化与RARβ的影响有很大联系，RARβ的低表达或者不表达对细胞的不良分化可能存在着相关因果［9－10]。实验发现，经过维甲酸作用干涉后，RARβ含量逐渐增加，基本符合此前的研究报道［11]，同时我们也认为维甲酸在SH-SY5Y中的作用可能是利用RARβ受体实现的，其有可能是研究分化机制的一类标志物［12]。这次实验细胞在维甲酸干涉后RARβ反应增强，进一步表明RARβ在ATPR作用于SH-SY5Y时有密切关系。

由以上的分析可以看出，ATPR在一定浓度范围内能够抑制SH-SY5Y增殖，上调RARβmRNA的表达，诱导其向正常成熟细胞分化。随着研究的深入，ATPR在神经母细胞瘤的临床应用中将得到广泛的使用，但其对神经母细胞瘤诱导分化的机制是否与其它基因有关仍需进一步探讨。

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