柔肝固肠方改善慢性酒精性肝损伤大鼠肠道通透性的机制研究

姚东升 胡义扬 傅琪琳 顾宏图 徐 琳 王文静 彭景华 赵 瑜 冯 琴

(上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学肝病研究所，上海高校中医内科学E-研究院，肝肾疾病病证实验室，上海市中医临床重点实验室，上海，201203)

柔肝固肠方改善慢性酒精性肝损伤大鼠肠道通透性的机制研究

姚东升 胡义扬 傅琪琳 顾宏图 徐 琳 王文静 彭景华 赵 瑜 冯 琴

(上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学肝病研究所，上海高校中医内科学E-研究院，肝肾疾病病证实验室，上海市中医临床重点实验室，上海，201203)

目的：从肠道紧密连接及黏附连接角度探讨柔肝固肠方改善慢性酒精性肝损伤大鼠肠道通透性的作用机制。方法：Lieber-DeCarli酒精液体饲料饲养6周诱导大鼠慢性酒精性肝损伤模型。30只SD雄性大鼠，随机分无酒精液体饲料对照组(对照组，n=10)和酒精液体饲料造模组(n=20)，造模第4周将造模组大鼠随机分模型组(n=10)，柔肝固肠方组(n=10)，并开始灌胃给柔肝固肠方或蒸馏水直至6周末，取材前3.5 h各组以10 mg/ kg的内毒素(LPS)灌胃。取材后检测：1)血清AST、ALT活性变化；2)通过门脉血浆内毒素含量测定判断小肠通透性变化；3)小肠组织电镜超微结构观察；4)小肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin蛋白与mRNA表达变化；5)小肠黏附连接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表达。结果：1)柔肝固肠方可显著降低模型大鼠显著升高的AST水平(P<0.05)；2)柔肝固肠方可降低模型大鼠显著升高的小肠通透性，柔肝固肠方组血浆内毒素含量显著低于模型组；3)电镜结果显示柔肝固肠方可显著改善Lieber-DeCarli酒精饲料喂养大鼠小肠黏膜表面微绒毛局灶性减少、变短、稀疏，排列不规则，同微绒毛相连的细胞终末网变性模糊等病理改变；4)柔肝固肠方可显著升高酒精饲料喂养肝损伤大鼠小肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin蛋白与mRNA表达及黏附连接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表达。结论：柔肝固肠方通过改善肠上皮紧密连接及黏附连接改善慢性酒精性肝损伤大鼠肠道通透性改变。

酒精性肝损伤；柔肝固肠方；肠道通透性；紧密连接；黏附连接

酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)是由于长期大量饮酒所导致的肝脏疾病。近些年来，研究证实肠道屏障功能障碍与酒精性肝损伤关系密切，酒精所致肠道通透性改变血中内毒素升高是形成酒精性肝病“二次攻击”理论的核心要素之一[1-2]。改善酒精所致的肠道屏障损伤，减少肠源性内毒素入血，为治疗ALD的重要和有效途径。

“饮食所伤”是酒精性肝病中医学重要的病因学说之一，调理脾胃运化功能是中医药治疗酒精性肝病的主要治法治则[3]。笔者所在研究所根据健脾活血立法创立的由白术、茯苓、白芍、泽泻等组成的“健脾活血方”临床治疗酒精性肝损伤疗效显著，近10多年来系列研究证实其通过改善肠道通透性、抗内毒素二次攻击以及抗脂质过氧化等多途径发挥抗酒精诱导的大鼠肝损伤的作用[4-6]。前期研究提示白芍、五味子及泽泻三味药(命名为“柔肝固肠方”)是健脾活血方8味中药中改善小肠通透性改变的主效应中药组合[7]。本研究采用Lieber-Decarli酒精饮料诱导的大鼠酒精性损伤模型，从肠道紧密连接及黏附连接角度探讨柔肝固肠方改善慢性酒精性肝损伤大鼠肠道通透性的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 SD雄性大鼠，SPF级，体重130～160 g，30只，合格证号SCKC-沪-2008-0016，购自上海必凯实验动物有限公司。特制笼具单笼饲养于上海中医药大学实验动物中心。特制Richter饲料瓶(负压饲料瓶)予大鼠自动饮用液体饲料。

1.2 药物 柔肝固肠方由白芍、五味子、泽泻组成。五味子加70%乙醇提取2次，过滤，回收乙醇；泽泻、白芍分别水提，滤液冷藏备用，临用前将三种药混合配成悬浊液。给药时配制成10 mL/kg鼠重的灌胃液。中药购自上海华宇药业有限公司，上海中医药大学科技中心制备。

1.3 试剂 血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase，ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase，AST)测定试剂盒购自南京建成生物制品研究所；内毒素检测试剂盒(货号21080309C/BU0209)购自美国ACC公司；ZO-1多克隆抗体(货号SC-10804)、E-cadherin(货号sc-7870)，购自santacruz公司；Occludin多克隆抗体(货号ab31721)，购自abcam公司；a-tublin多克隆抗体(货号2251-1)，购自EPITOMICS公司。β-Catenin抗体(货号9582S)，购自CST公司；柱式小量总RNA抽提试剂盒，购自上海华舜生物工程有限公司；cDNA合成试剂盒，购自Fermentas公司；引物由TAKARA公司设计、上海生工生物工程技术服务有限公司合成。荧光定量PCR试剂盒，购自TAKARA公司产品；引物序列及片段长度如下(表1)。

表1 引物序列及片段长度

2 方法

2.1 模型制备 Lieber-DeCarli酒精性大鼠肝损伤模型制备及取材方法，参照本课题组已发表文献[4]。

2.2 分组与给药 大鼠30只，随机分无酒精液体饲料对照组(对照组，n=10)和酒精液体饲料造模组(造模组，n=20)，造模第4周将造模大鼠随机分模型组(n=10)，柔肝固肠方组(n=10)，柔肝固肠方组在给予酒精饲料的同时，灌胃给予1 mL/100 g体重药物，1次/d，模型组、对照组按相同标准灌胃给予饮用水。

2.3 观察指标及方法 1)血清AST、ALT活性，赖氏法。2)小肠通透性通过门静脉血浆内毒素含量检测判定(鲎试剂法)。3)小肠组织电镜超微结构观察。4)小肠紧密连接蛋白ZO-1及Occludin蛋白及mRNA表达变化，Western Blotting(WB)和Real-time PCR(RT-PCR)方法。5)小肠黏附连接蛋白β-Catenin和E-Cadherin蛋白表达，WB方法。

3 结果

3.1 各组大鼠死亡情况、进食量、体重变化 造模开始及结束时各组大鼠体重均无统计学意义(P>0.05)(见表2)；在造模过程中各组大鼠进食量无统计学意义(P>0.05)(见表2)，其所摄入的乙醇量和热卡也大致相等，排除了饮食及乙醇量的差异对实验结果的影响；造模第6周柔肝固肠方组有1只大鼠因灌胃不当意外死亡。

表2 各组大鼠体重及进食量±s)

3.2 柔肝固肠方对慢性酒精性肝损伤大鼠血清AST、ALT的影响 与对照组相比，模型组血清ALT、AST活性显著升高；与模型组相比，柔肝固肠方组能显著降低血清AST活性。(见表3)。

表3 各组大鼠血清ALT、AST含量

注：**P<0.01，*P<0.05，vs对照组；##P<0.01，vs模型组。

3.3 柔肝固肠方对慢性酒精性肝损伤大鼠肠道通透性(门静脉血浆内毒素含量)的影响 模型组大鼠门静脉血浆内毒素含量较对照组组明显升高(P<0.05)，柔肝固肠方组门静脉血浆内毒素含量有显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)(表4)

表4 各组大鼠门静脉血浆内毒素含量±s)

注：*P<0.05，vs对照组；##P<0.01，#P<0.05，vs模型组。

3.4 柔肝固肠方对慢性酒精性肝损伤大鼠小肠组织超微结构的影响 对照组小肠黏膜超微结构未见明显改变。模型组大鼠小肠黏膜表面微绒毛局灶性减少、变短、稀疏，排列不规则。同微绒毛相连的细胞终末网变性模糊。柔肝固肠方小肠黏膜表面上皮细胞间各种连接结构较为清晰，微绒毛局灶性稀疏、减少等有所改善，上皮细胞变性程度轻微。(图1)

图1 小肠电镜超微结构变化(11500倍)

注：N对照组，M模型组，R柔肝固肠方组。

3.5 柔肝固肠方对对慢性酒精性肝损伤大鼠小肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin蛋白及mRNA表达的影响 与对照组相比，模型组小肠ZO-1、Occludin蛋白表达显著降低；柔肝固肠方组ZO-1蛋白表达较模型组均显著升高。(图2)

与对照组相比，模型组小肠组织ZO-1mRNA表达无显著变化，Occludin mRNA表达显著降低，柔肝固肠方组ZO-1、OccludinmRNA表达均显著升高。(表5)

图2 各组小肠ZO-1、Occludin蛋白表达情况

注：N：对照组，M：模型组，R：柔肝固肠方组。

表5 各组大鼠小肠组织ZO-1、Occludin mRNA表达

注：**P<0.01，vs对照组；##P<0.01，#P<0.05，vs模型组。

3.6 柔肝固肠方对小肠黏附连接蛋白β-Catenin、E-Catenin影响 与对照组相比，模型组小肠β-Catenin、E-Catenin蛋白表达均显著降低；柔肝固肠方组较模型组均显著升高。(图3)

图3 各组小肠β-Catenin、E-Catenin蛋白表达情况

注：N：对照组，M：模型组，R：柔肝固肠方组

4 讨论

ALD发病原因明确，为过量摄入乙醇所致。乙醇所致血中内毒素升高是形成酒精性肝病(ALD)“二次攻击”理论的要素之一。乙醇导致肠道黏膜屏障的破坏，形成肠渗漏被认为是乙醇诱导的内毒素血症的主要原因，因此通过改善肠道屏障功能抑制内毒素升高是ALD治疗学上的重要策略[2]。

柔肝固肠方是临床治疗ALD有效经验方健脾活血方中改善小肠通透性改变的主效应中药组合[7]，研究证实其可减轻酒精性肝损伤，且其改善小肠通透性有优于健脾活血方的趋势。但其通过何种机制改善肠道屏障功能尚不明了，有必要进一步深入研究。

肠道屏障功能是指能防止肠腔内有害物质如细菌及毒素等穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环的结构和功能，主要由肠道黏膜的机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障四部分组成[8]。机械屏障是其中最重要的部分，小肠上皮机械屏障功能主要由上皮细胞细胞间连接复合物包括紧密连接和黏附连接提供[9]。其中紧密连接是调节细胞间通透性的细胞间连接复合物中最重要的组分，是防御异物入血的第一道防线[10]。紧密连接[10-11]是由超过50种蛋白质组成的结构复杂的复合体，通过连接与细胞骨架结构连接的复合物蛋白构成紧密连接复合物来吻合封闭细胞间隙。紧密连接胞内蛋白主要是ZO-1蛋白，其起到桥梁的作用。一方面，ZO-1自身的C末端同肌动蛋白骨架系统相连接，另一方面，ZO-1通过鸟苷酸激酶样(GUK)结构域的保守序列，与紧密连接的跨膜蛋白蛋白如Occludins蛋白的C末端连接。最终，将Occludin蛋白和肌动蛋白骨架系统连接在一起，构成稳定的连接系统。Occludin蛋白是主要集中于紧密连接纤维内相对分子质量约为65 000的Ⅱ型跨膜蛋白，其蛋白的胞外环型结构及跨膜结构主要参与肠壁通透性的调节。紧密连接蛋白的破坏会导致肠道通透性增高，使大分子物质，如内毒素、病原体等从肠腔进入血液。黏附连接[12]为肠道机械屏障的另一重要组成部分。一般于上皮细胞顶侧面的紧密连接下方形成粘合带(Adhesion Belt)。在粘合带处相邻细胞的间隙约15～20 nm。间隙中的粘合分子为E-钙粘蛋白(E-cadherin)。粘合带处的质膜下方有与质膜平行排列的肌动蛋白束，钙粘蛋白通过附着β-连锁蛋白(β-catenin)等连锁蛋白、粘着斑蛋白(Vinculin)、α-辅肌动蛋白(α-actinin)和片珠蛋白(Plakoslobin)与肌动蛋白束相结合。于是，相邻细胞中的肌动蛋白丝束通过钙粘蛋白和附着蛋白编织成了一个广泛的网络，把相邻细胞联合在一起。近来研究发现乙醇代谢产物乙醛可通过介导E-cadherin与β-catenin的酪氨酸磷酸化而且破坏黏附连接蛋白。

本研究运用Lieber-Decarli酒精饲料喂养大鼠6周诱导慢性酒精性肝损伤模型，并参照文献方法[5]，于动物处死前3.5 h给予内毒素灌胃，取材后测定门静脉血浆血内毒素含量以评价肠道通透性。结果显示模型大鼠门静脉血浆内毒素含量较无酒精饲料对照大鼠显著升高，说明该模型中肠渗漏发生，存在肠道屏障受损。小肠组织电镜超微结构也显示酒精饲料喂养大鼠出现小肠黏膜表面微绒毛局灶性减少、变短、稀疏，排列不规则，同微绒毛相连的细胞终末网变性模糊等病理改变。同时，WB研究结果显示模型大鼠小肠组织紧密连接蛋白ZO-1、Occludin及黏附连接蛋白β-Catenin、E-cadherin蛋白表达均显著低于无酒精饲料对照大鼠，提示小肠上皮紧密连接与黏附连接的破坏是该慢性酒精性肝损伤模型肠道通透性升高的主要原因。经中药柔肝固肠方治疗后，模型大鼠血清AST显著降低同时伴有肠道通透性关键指标——血浆门静脉内毒素含量的显著降低及小肠黏膜超微结构的好转，提示改善肠通透性抑制内毒素血症是该方有效治疗酒精性肝损伤的重要机制之一。进一步检测该方对小肠上皮紧密连接与黏附连接关键蛋白的影响，结果显示无论紧密连接蛋白ZO-1、Occludin还是黏附连接蛋白β-Catenin、E-cadherin经过柔肝固肠方治疗后蛋白表达均较模型组显著升高，提示缓解慢性酒精摄入导致的肠上皮细胞紧密连接及黏附连接破坏是该方修复肠道黏膜机械屏障、改善肠道通透性的主要机制。

综上所述，柔肝固肠方可通过修复肠上皮细胞紧密连接及黏附连接而改善酒精性肠道通透性改变起到防治ALD的作用。这为该方临床运用与新药开发提供科学依据同时，也为从“肝-肠轴”角度开展中医药防治酒精性肝病的研究提供可借鉴的思路与方法。

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(2014-12-26收稿 责任编辑：洪志强)

Mechanism research of Rouganguchang Decoction on improving intestinal permeability changes of rats with ethanol-induced liver injury

Yao Dongsheng, Hu Yiyang, Fu Qilin, Gu Hongtu, Xu Lin, Wang Wenjing, Peng Jinghua， Zhao Yu, Feng Qin

(InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicinet,Shanghai201203,China)

Objective:From the intestinal tight junction and adherens junction pathway to explore mechanism research of Rouganguchang Decoction on improving chronic alcoholic liver injury and intestinal permeability changes. Methods: The rats were given Lieber-Decarli liquid diet daily for 6 weeks to duplicate the alcoholic liver injury model. Thirty male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control liquid diet, control group (control group, n = 10) and ethanol liquid diet model group (n = 20). Model rats were randomly divided into the model group (n = 10), Rouganguchang Decoction group (n = 10) the fourth weeks. The rats were given decoction or distilled water from the fourth week to the sixth weekend. Each rat was given 10mg/kg endotoxin (LPS) by gavage 3.5h before being sacrificed. The following indexes were detected: 1)The ALT、AST activity of serum were detected by biochemical method; 2)LPS content in the portal blood was detected by biochemical method; 3)Pathological changes in intestinal tissues were observed by electron microscope; 4)The protein and mRNA expresses of ZO-1 and Occludin were detected by Western blotting and real-time PCR respectively; 5)The protein of beta-Catenin and E-Cadherin were detected by Western blotting. Results:1) Compared with that of the model group rats, the activity of AST in drug group decreased significantly (P<0.05); 2) The plasma endotoxin levels of Rouganguchang Decoction decreased significantly compared with that of the model group rats; 3) Rouganguchang Decoction could improve the intestinal mucosa connection structure of the surface epithelial cells of model rats; 4) Compared with those of the model group rats, the protein and mRNA expressions of ZO-1 and occludin, as well as the protein expressions of beta-Catenin and E-Cadherin all increased. Conclusion: Rouganguchang Decoction can significantly improve chronic alcoholic liver injury and intestinal permeability changes, the mechanism of that was related to protection of intestinal epithelial tight junctions and adhesion junctions.

Alcoholic liver injury; Rouganguchang Decoction; Intestinal permeability; Intestinal tight junctions; Intestinal adhesion junctions

国家自然基金青年基金项目(编号：30801536)；国家中医药管理局中医肝胆病重点学科资助项目

R256.43

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.006