祛湿化瘀方通过调节AMPK活性改善高脂饮食诱导的实验性脂肪肝肝脏脂肪代谢

冯 琴 孟胜喜 唐亚军 李晓飞 彭景华 赵 瑜 胡义扬

(上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学肝病研究所，上海高校中医内科学E-研究院，教育部肝肾疾病病证实验室，上海市中医临床重点实验室，上海，201203)

祛湿化瘀方通过调节AMPK活性改善高脂饮食诱导的实验性脂肪肝肝脏脂肪代谢

冯 琴 孟胜喜 唐亚军 李晓飞 彭景华 赵 瑜 胡义扬

(上海中医药大学附属曙光医院，上海中医药大学肝病研究所，上海高校中医内科学E-研究院，教育部肝肾疾病病证实验室，上海市中医临床重点实验室，上海，201203)

目的：研究祛湿化瘀方对高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝AMPK蛋白活性及其相关脂肪代谢靶蛋白活性的影响，以探讨该方防治实验性脂肪肝的作用机制。方法：采用高脂饲料饮食诱导大鼠脂肪肝模型，造模大鼠给予高脂饮食4周后，按随机数字表随机分为模型组及祛湿化瘀方组，分别灌胃给予饮用水及中药祛湿化瘀方4周。实验8周末取材后观察：1)肝组织三酰甘油(Triglyceride，TG)、游离脂肪酸(Free Fatty Acid，FFA)含量，2)肝组织病理变化(HE染色、油红染色)，3)肝组织腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-Activated K inase，AMPK)及磷酸化AMPK、肝组织总蛋白及核蛋白固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c、SREBP-1c)、肝组织总蛋白及核蛋白碳水化合物反应元件结合蛋白(Carbohydrate Response Element Binding Protein、ChREBP)含量、肝组织乙酰辅酶A羧化酶(Acety1 CoA Carboxylase，ACCase)及磷酸化ACC蛋白含量，4)肝组织AMPKα1、AMPKα2、SREBP-1、ACCα、SREBP-1c及ChREBP基因表达水平。结果：1)模型组肝组织TG、FFA含量显著升高，肝组织出现明显大泡样脂肪变性；模型组肝组织AMPK蛋白磷酸化水平降低、核蛋白SREBP-1与ChREBP表达增加、ACC蛋白磷酸化水平降低蛋白活性升高。2)祛湿化瘀方组肝组织TG、FFA含量较模型组显著降低，肝组织炎症及脂肪变性程度减轻；祛湿化瘀方能显著升高肝组织AMPK、ACC蛋白磷酸化水平、降低核蛋白SREBP-1及ChREBP含量。结论：祛湿化瘀方通过调节AMPK活性及其相关靶蛋白活性改善高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝肝脂肪代谢，这可能是该方有效防治实验性脂肪肝的重要作用机制之一。

实验性脂肪肝；腺苷酸活化蛋白激酶；祛湿化瘀方；肝脂肪代谢

肝脏脂肪代谢功能障碍，肝细胞内三酰甘油(Triglyceride，TG)含量过度升高是非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver,NAFL)最基本的病理改变[1]。前期研究反复证实了祛湿化瘀方对实验性NAFL大鼠肝组织三酰甘油和FFA降低效应显著[2-4]。单磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作为一类重要的蛋白激酶，在NAFLD的发病过程中起重要作用。AMPK由于广泛介导了机体主要糖脂代谢组织的调控过程，成了目前代谢性疾病的研究热点，也是目前研究治疗NAFLD药物作用靶点之一[5]。本研究围绕AMPK活性及受其调节的与脂肪代谢相关靶蛋白活性，运用高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝体内模型探讨祛湿化瘀方降低NAFL肝脂肪含量改善脂质代谢的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠30只，体重(170±20)g，清洁级，购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)2003-0002。上海中医药大学实验动物中心清洁级动物房饲养、造模与观察，自由饮水。

1.2 主要试剂 TG试剂盒，浙江东欧生物工程公司，Lot No.2009.11.0003；游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)试剂盒，南京建成生物有限公司，Lot No.20100409；BCA蛋白浓度测定试剂盒，Lot No.P0012；RNA抽提试剂盒，Lot No.2608A，购自上海华舜生物工程有限公司；核蛋白提取试剂盒(Cytoplasmic and Nuclear Protein Extraction Kit),Fermentas产品，Lot：00069231；多克隆AMPKα抗体、多克隆p-AMPKα(Thr172)、p-ACC(Ser79)抗体及多克隆ACC抗体均为Cell Signaling Technology公司产品；多克隆SREBP-1抗体、多克隆CHREBP抗体为Abcam公司产品；单克隆α-Tublin抗体为EPITMICS公司产品。多克隆Lamin B抗体为Santa Cruze公司产品；RNA抽提试剂盒，Cat No.W6701，Lot No.2608A，购自上海华舜生物工程有限公司；cDNA合成试剂盒，Lot No.1310，Fermentas公司产品；荧光定量PCR试剂盒，Lot No.BK4402，TAKARA公司产品；PCR引物由TAKARA公司设计、上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列及片段长度如下(表1)。

1.3 实验药物 祛湿化瘀方组成:茵陈15 g、虎杖12 g、田基黄12 g、姜黄9 g、生栀子9 g，均购自上海华宇药业有限公司。栀子、田基黄水提醇沉，茵陈、姜黄、虎杖醇提，配成0.93 g生药/mL浓度用以灌胃给药。

1.4 模型制备方法 大鼠饲以高脂饲料(88%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油)8周。饲料购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.5 动物分组和给药 SD雄性大鼠30只，按计算机随机数字表分为正常组10只、造模组20只，造模大鼠给予高脂饲料造模四周后，随机分为模型组、祛湿化瘀方治疗组各10只。继续给予高脂饲料造模同时，治疗组灌服祛湿化瘀方药液(0.93 g生药/100 g鼠重)，模型组给予相应量的生理盐水灌胃，共给药4周。

2 结果

2.1 祛湿化瘀方对NAFL模型大鼠肝脏脂肪含量的影响 与正常组相比，模型组大鼠肝组织TG、FFA含量均显著升高(P<0.01，P<0.01)，祛湿化瘀方有很显著的降低组织TG、FFA的作用(P<0.01，P<0.05)，祛湿化瘀方组肝组织TG、FFA含量分别为模型组的53.4%、65.9%。(见表2)。

表2 各组大鼠肝组织脂肪含量±s)

注：*P<0.05，**P<0.01，vs模型组。

2.2 祛湿化瘀方对NAFL模型大鼠肝组织病理的影响 HE染色显示：模型组大鼠均出现不同程度的脂肪变性及空泡样变，变性的肝细胞极度肿胀呈圆形，体积较正常明显增大，胞浆内充满大量脂肪空泡，部分细胞可见细胞核挤向胞膜。肝小叶内可见多处的点状坏死灶，坏死区及少量汇管区有炎细胞浸润。祛湿化瘀方组大鼠脂肪变性程度及细胞肿胀明显减轻，胞内脂滴数量相对减少，炎性细胞浸润及坏死灶较模型组减少。油红O染色显示与正常大鼠相比模型大鼠肝细胞明显肿大、变圆，胞内呈现深浅不等的油红着色，中央静脉周围的肝细胞油红染色较深。祛湿化瘀方组肝细胞肿大程度与胞内脂肪油红着色程度都比模型组相对浅。(图略)

依据非酒精性脂肪性肝病诊疗指南[6]，组织病理学诊断将肝细胞脂肪变性分为4度(F0-4)：F0，<5%肝细胞脂肪变；F1，5%～30%肝细胞脂肪变；F2，30%～50%肝细胞脂肪变性；F3，50%～75%肝细胞脂肪变；F4，75%以上肝细胞脂肪变。Ridit分析结果显示：模型组脂肪变性程度较正常组显著升高(P<0.01)，祛湿化瘀方组脂肪变性程度较模型组显著降低(P<0.05)(见表3)。

表3 各组肝组织病理HE染色脂肪变性比较

注：*P<0.05，**P<0.01，vs正常组；△P<0.05，vs模型组。

图1 各组AMPK、p-AMPK、ACCα 及p-ACCα蛋白表达情况

注：(A)WB图片，(B)WB图片条带灰度积分半定量柱状图；ND，HFD，HFD+QHD分别为正常组、模型组及祛湿化瘀方组；*P<0.05，**P<0.01，vs正常组；##P<0.01，vs模型组。

2.3 祛湿化瘀方对NAFL大鼠肝组织AMPK及磷酸化AMPK蛋白含量、总蛋白及核蛋白SREBP-1、CHREBP含量、以及肝组织ACC及磷酸化ACC蛋白含量的影响 与正常组相比模型大鼠肝组织AMPK含量稍有下降，祛湿化瘀方干预后没有显著变化，但肝脏AMPK活性形式p-AMPK含量模型组较正常组显著降低，祛湿化瘀方组能显著升高p-AMPK含量，提高AMPK蛋白活性。

模型组大鼠肝组织ACCα蛋白含量与正常组相比无统计学意义，但祛湿化瘀方干预后，高脂饮食模型大鼠肝组织ACCα蛋白含量显著降低。模型组ACCα蛋白Ser79磷酸化水平显著低于正常组，祛湿化瘀方干预能显著提高模型大鼠ACCα蛋白磷酸化水平。

与正常组相比，模型组肝组织总蛋白中SREBP-1蛋白含量显著升高，祛湿化瘀方组与模型组相比没有太大变化。对于能体现蛋白活性的核蛋白SREBP-1蛋白含量模型组显著高于正常组，且祛湿化瘀方有显著的降低效应。

模型组大鼠肝组织总蛋白CHREBP含量与正常组相比无统计学意义，但祛湿化瘀方干预后，高脂饮食模型大鼠肝组织总蛋白CHREBP含量显著降低。对于具有蛋白活性功能的核蛋白CHREBP含量，模型组显著高于正常组，且祛湿化瘀方治疗组显著低于模型组。

图2 各组肝组织总蛋白及核蛋白 SREBP-1、CHREBP表达情况

注：(A)WB图片，(B)WB图片条带灰度积分半定量柱状图；ND，HFD，HFD+QHD分别为正常组、模型组及祛湿化瘀方组；*P<0.05，**P<0.01，vs正常组；##P<0.01，vs模型组。

2.4 祛湿化瘀方对NAFL大鼠肝组织AMPKα1、AMPKα2、SREBP-1、ACCα、SREBP-1c及CHREBP基因表达的影响 模型大鼠AMPKα1基因表达较正常组显著降低，模型大鼠AMPKα2基因表达与正常组相比虽无统计学意义，有较大幅度降低，祛湿化瘀方与模型组相比AMPKα1、AMPKα2均有降低趋势。模型组肝组织SREBP-1基因表达量显著高于正常组，祛湿化瘀方组与模型组相比有降低趋势。正常组、模型组与祛湿化瘀方组肝组织CHREBP/ACCα基因表达均无统计学意义。(见表4)。

表4 各组肝脏AMPKα1、AMPKα2、SREBP-1、CHREBP

注：*P<0.05，vs正常组。

3 讨论

“祛湿化瘀方”由茵陈、栀子等5味中药组成，是临床治疗NAFLD的有效中药复方[7]。近10年十余次动物实验反复证实了该方显著降低实验性NAFL大鼠肝脏脂肪含量、减轻肝脏炎症的药理效应，其降低肝组织TG和FFA降低效应尤为显著[2-4]。

AMPK在肝脏脂质稳态调节中发挥重要作用。AMP激活的AMPK作为一类重要的蛋白激酶与肥胖及代谢综合征相关疾病的发病密切相关[4],成为近年来研究的热点。AMPK系统是细胞能量的感受器。当代谢应激时，ATP生成减少(例如葡萄糖和氧缺乏)而消耗增加(例如肌肉收缩)，细胞内AMP：ATP的比值升高，AMPK即被激活。一旦被激活，AMPK打开产生ATP的分解代谢通路而关闭消耗ATP的过程，例如生物合成，细胞生长及增值。AMPK复合物由α催化亚单位和β、γ调节亚单位构成，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其中α亚单位的苏氨酸172位点及其磷酸化对AMPK活性的调节起重要作用，一旦172位苏氨酸磷酸化，AMPK被激活为有活性的p-AMPK形式，则可通过调节下游蛋白激酶或调控各种基因表达从而影响机体的能量代谢。AMPK在细胞能量平衡中的作用主要是通过对代谢酶的快速直接的修饰(磷酸化)实现的。

多项研究表明，无论在先天瘦素基因缺乏的ob/ob小鼠还是高糖或高脂饮食诱导的NAFLD动物模型中均存在AMPK磷酸水平及活性的降低，AMPK基因及蛋白活性的改变在NAFLD的发病过程中起重要作用[8-9]。乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase，ACC)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMG-CoA)是最早发现的两个AMPK的靶蛋白，其分别是脂肪酸和胆固醇合成过程中的关键酶。ACC是丙二酸单酰辅酶A合成过程中的限速酶，而丙二酸单酰辅酶A既是脂肪酸合成的前体，又可抑制肉碱棕榈酰转移酶-1的活性从而干扰长链脂酰辅酶A进入线粒体，最终抑制线粒体脂肪酸氧化。因此，AMPK通过磷酸化ACC抑制其活性，降低肝细胞中丙二酸单酰辅酶A的含量，从而抑制脂肪酸的合成并增强线粒体对脂肪酸的利用和氧化[4]。

SREBP-1C是调节糖脂代谢的重要转录因子，它直接参与调控有关脂质合成相关酶基因如ACC、FAS、SCD的表达，增加肝脏脂质合成[10]。ChREBP是一在糖脂代谢过程中发挥重要作用的转录因子[10]，ChREBP的靶基因主要是参与糖酵解和脂质合成的一些酶类，因而ChREBP的激活可促进葡萄糖向脂质转化。AMPK可以减少再摄食诱导SREBP-1c和ChREBP的转录激活。此外，AMPK还能够磷酸化ChREBP Ser568位点，使其与DNA的结合能力下降，从而抑制葡萄糖反应性基因的转录[11]。

鉴于AMPK蛋白活性及其调节的脂肪代谢相关靶蛋白活性改变在NAFL的发病过程中的重要作用，祛湿化瘀方显著降低实验性脂肪肝肝脏脂肪含量有效防治NALF是否与调节该蛋白活性相关呢？本研究运用高脂饮食诱导的大鼠脂肪肝模型观察祛湿化瘀方对AMPK蛋白活性及其相关脂肪代谢靶蛋白SREBP-1、CHREBP、ACC活性的影响，以探讨该方有效防治实验性脂肪肝的作用机制。

研究结果证实在高脂饮食诱导的NAFL模型中存在AMPK基因与蛋白磷酸化水平的下降、核蛋白SREBP-1及CHREBP表达的升高及ACC蛋白磷酸化水平的下降，揭示了AMPK及其调控的脂肪代谢通路与该模型肝脏脂肪过度沉积的之间的关系。同时，研究结果也显示祛湿化瘀方干预后模型大鼠AMPK、ACC磷酸化水平显著升高、核蛋白SREBP-1及CHREBP含量显著降低，提示该复方对该模型AMPK活性及其相关的靶蛋白有良性调节作用。这可能是该方改善肝脏脂肪代谢、有效防治NAFLD的重要机制之一。

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(2014-12-26收稿 责任编辑：洪志强)

Qushi Huayu Decoction Inhibits Hepatic Lipid Accumulation by Activating AMP-Activated Protein Kinase in Experimental Fatty Liver of Rats

Feng Qin， Meng Shengxi， Tang Yajun， Li Xiaofei， Peng Jinghua， Zhao Yu,Hu Yiyang

(InstituteofLiverDiseases,ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicinet,Shanghai201203,China)

Objective: The present study was conducted to investigate whether Qushi Huayu Decoction (QHD) could inhibit hepatic lipid accumulation by activating AMP-activated protein kinase (AMPK) in experimental fatty liver of rats. Methods: Nonalcoholic fatty liver (NAFL) model was duplicated with high-fat diet in rats. Results: QHD significantly decreased the accumulation of fatty droplets in livers, lowered triglyceride (TG) and free fatty acid (FFA). Moreover, QHD supplementation reversed the HFD-induced decrease in the phosphorylation levels of AMPK and acetyl-CoA carboxylase (ACC) and decreased hepatic nuclear protein expression of sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1) and carbohydrate-responsive element-binding protein (ChREBP) in the liver. Conclusion: QHD has significant effect on inhibiting hepatic lipid accumulation via AMPK pathway in vivo.

Experimental fatty liver; AMP-activated protein kinase (AMPK); Qushi Huayu Decoction; Hepatic lipid metabolism

国家自然基金面上项目(编号：81374031，81173404)；上海市自然基金项目(编号：13ZR1442600)

R256.49

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.02.002