20株奇异变形杆菌耐药基因和整合子分布及亲缘关系分析*

冯福英，杨湘越，洪 宇，郑宗富，张 薇，蒋际城，曾 琦

（1.中国人民解放军第四七六医院检验科，福建福州 350002；2.南京军区福州总医院医学检验研究所，福建福州 350025）

20株奇异变形杆菌耐药基因和整合子分布及亲缘关系分析*

冯福英1，杨湘越2，洪 宇1，郑宗富1，张 薇1，蒋际城1，曾 琦1

（1.中国人民解放军第四七六医院检验科，福建福州 350002；2.南京军区福州总医院医学检验研究所，福建福州 350025）

目的了解该院神经内科病区奇异变形杆菌院内感染状况与耐药机制。方法对20株不重复奇异变形杆菌采用PCR法检测超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素（AmpC）酶、碳青霉烯酶（KPC）和金属β内酰胺酶（MBLs）耐药基因并测序；PCR法检测整合子并测序；脉冲场凝胶电泳法分析菌株间亲缘关系；对这20株奇异变形杆菌进行药敏试验并分析。结果从这20株奇异变形杆菌中均检测出TEM-1和CTX-M-14型耐药基因，10株菌中分离出CMY-2型耐药基因。从19株菌中扩增出Ⅰ类整合子，分别整合的基因盒有“aac A4+cml A1”，“dfr A12+orf F+aad A2”和“dfr A32+ere A+aad A2”。脉冲场凝胶电泳结果聚类分析20株菌可分为P1～P11的11个PFGE型别，其中P1～P3的12株菌为同一克隆株。20株菌对美罗培南、阿米卡星、氨曲南、头孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦的敏感率高。结论该院神经内科病区出现奇异变形杆菌同克隆株的传播；携带的耐药基因以CTX-M-14和CMY-2型为主；Ⅰ类整合子携带率高，耐药基因盒以“aac A4+cml A1”和“dfr A12+orf F+aad A2”为主；菌株对美罗培南、阿米卡星和氨曲南均为敏感；临床科室应同样重视由奇异变形杆菌引起的院内感染，加强感染控制措施。

奇异变形杆菌； 耐药基因； 整合子； 脉冲场凝胶电泳

奇异变形杆菌为条件致病菌，也是院内感染菌之一。本院2012年12月至2013年2月从神经内科住院患者临床标本中密集地分离出奇异变形杆菌。为了解本科室住院患者奇异变形杆菌耐药基因和整合子的分布及它们的亲缘关系，笔者对20株不重复菌进行了头孢菌素（AmpC）酶、超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、碳青霉烯酶（KPC）和金属β内酰胺酶（MBLs）等耐药基因的扩增，进行了整合子的检测和脉冲场凝胶电泳（PFGE）的分析和药敏试验，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 分离的20株奇异变形杆菌来自神经内科住院患者标本，包括14例痰液、5例尿液、1例胸腔脓液。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定及药敏试验 采用美国BD公司PhoenixTM100革兰阴性杆菌复合板条（NMIC/ID-4）进行菌株鉴定及药敏试验，依据CLSI M100-S23版文件的标准判读药物敏感试验结果。

1.2.2 细菌基因组模板制备 用OMEGA Bio-Tek公司生产的细菌基因组抽提试剂盒抽提菌株基因组，基因组样品终体积为50μL。

1.2.3 质粒DNA模板制备 用OMEGA Bio-Tek公司生产的小量质粒抽提试剂盒（Plasmid Mini KitⅠ）抽提菌株质粒，质粒样品终体积为50μL。

1.2.4 耐药基因的检测 采用PCR法，AmpC酶和ESBLs基因的引物合成和扩增条件按文献［1］进行；KPC和MBLs（IMP、VIM、NDM）基因的引物合成和扩增条件见表1。采用大连宝生物有限公司的TaKaRa TaqTMHot Start Version试剂盒。

1.2.5 整合子的检测 采用PCR法，在整合子的保守序列中设计引物5′CS：5′-GGC ATC CAA GCA GCA AG-3′，3′CS：5′-AAG CAG ACT TGA CCT GA-3′。

1.2.6 PCR产物测序与分析 产物在含0.5 g/mL溴化乙啶的1.0%琼脂糖凝胶中电泳，出现目的条带的判为阳性，切胶回收纯化；纯化产物委托伯尚生物技术上海有限公司测序；所测序列与GenBank数据库进行比对以确定基因型。

1.2.7 PFGE 用限制性内切酶SfiⅠ（NEB公司产品）进行酶切。实验方案参照美国病原菌分子分型监测网络Pulse Net标准实验方案进行；用Bionumerics软件Cluster analysis模块进行聚类分析。

2 结 果

2.1 耐药基因检测 20株菌中均检测到β-内酰胺酶的TEM-1型和ESBLs的CTX-M-14型基因，从10株菌中检测到AmpC酶的CMY-2型基因；未检测到SHV型、KPC和MBLs（IMP、VIM、NDM）基因；部分PCR产物电泳结果见图1、2。图

2.2 整合子检测 19株菌检测到Ⅰ类整合子；17株菌扩增出的二个可变区中，2 256 bp大小的可变区内含“aac A4+ cml A1”基因盒，1 864 bp大小的可变区内含“dfr A12+orf F+ aad A2”基因盒；2株菌扩增出3 002 bp的可变区，内含“dfr A32 +ereA+aad A2”基因盒；1株菌未扩增出整合子；部分整合子PCR产物电泳结果见图3。

2.3 药物试验 20株分离菌的药敏试验结果见表2。

2.4 PFGE及聚类分析 20株菌PFGE后，可见8～14条大小不一的电泳条带。聚类分析显示，菌株间条带相似度为47.013%～100.000%之间；按照100%的相似度可将菌株酶切图谱分为11种型别（PFGE type），记为P1～P11，大部分型别只有1个菌株，P1型包含10个株菌。PFGE聚类分析结果见图4（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。

3 讨 论

分析的20株奇异变形杆菌均为产ESBLs菌株，ESBLs的检出率明显高于文献［2-3］报道的16.1%和10.7%，20株菌携带的耐药基因型均为CTX-M-14，与文献［2］报道的以CTXM-15基因型为主的结果略有差异，但均为CTX-M型耐药基因；从10株菌中扩增出AmpC酶CMY-2型基因，50%的检出率明显高于文献［4-5］报道的1.4%和0.1%，基因型与文献［4-6］报道的基因型相同；20株菌中10株菌同时产ESBLs和AmpC酶，产超超广谱β-内酰胺酶（SSBL）菌的阳性率为50%。本院检出的奇异变形杆菌的ESBLs基因型以CTX-M型为主，AmpC酶的基因型以CMY型为主。

整合子是细菌中的一种可移动性基因元件，在耐药基因的水平转移中起到了至关重要的作用。分析的20株奇异变形杆菌中19株扩增出Ⅰ类整合子，阳性率（95%）明显高于文献［7］38.6%的报道。整合的耐药基因产物可导致奇异变形杆菌对氯霉素、三甲氧苄啶、红霉素、链霉素和壮观霉素的耐药。

药敏试验结果提示美罗培南、阿米卡星、氨曲南、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦和头孢他啶可作为对奇异变形杆菌感染治疗的首选用药或经验用药。16株菌对亚胺培南耐药，与文献［8］报道的主要因产碳青霉烯酶所致耐药的原因不同，均未检出碳青霉烯酶和金属酶，可能与其他机制有关，有待进一步研究。

按80%的相似度为标准［9］，PFGE聚类分析中的三个PFGE型别的1～12号菌株判为同一菌株来源；通过临床调查，分离出奇异变形杆菌的这些病患均有住过该病区ICU病房的经历，而该ICU病房因危重患者多，床位之间的距离未达到一米以上的要求，加之可能的其他感染控制措施的不到位，造成了此次奇异变形杆菌的院内感染。

此次研究结果揭示本院神经内科病区出现奇异变形杆菌的院内感染；均为产ESBLs株，其中SSBL菌占50%，携带的耐药基因型为CTX-M-14和CMY-2；Ⅰ类整合子的携带率高达95%；美罗培南、氨曲南、阿米卡星、头孢他啶和加酶抑制剂的抗菌药物可作为首选用药或经验用药；本院分离的耐亚胺培南株与KPC和MBLs无关；临床科室应加强院内感染控制措施的落实，避免或减少院内感染的发生。

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［3］石兰峰，钮博.奇异变形杆菌ESBL和AmpC酶的检测与耐药分析［J］.中国厂矿医学，2009，22（1）：75-76.

［4］ 陈晓莉，徐元宏，黄颖，等.变形杆菌临床分离株的耐药性分析及其AmpC酶的检测［J］.安徽医科大学学报，2007，42（4）：395-398.

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Study on distribution of drug resistance gene and integron and analysis of genetic relationship of 20 isolates of Proteus mirabilis*

Feng Fuying1，Yang Xiangyue2，Hong Yu1，Zheng Zongfu1，Zhang Wei1，Jiang Jicheng1，Zeng Qi1

（1.Department of Clinical Laboratory，the 476th Hospital of PLA，Fuzhou，Fujian 35002，China；2.Institute of Laboratory Medicine，Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command，Fuzhou，Fujian 350025，China）

ObjectiveTo investigate the prevalence and resistance mechanisms of Proteus mirabilis in the ward of neurology department of our hospital.MethodsFor a total of 20 clinic isolates of Proteus mirabilis，PCR were used for the detection of AmpC，ESBLs，KPC and MBLs and then DNA sequencing was performed.The integrons were also detected by using PCR and then sequencing was carried out.The genetic relationship between isolates were detected and analysed by pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）.The results of drug sensitivity tests were analysed.ResultsTEM-1 and CTX-M-14 gene were found in all the 20 isolates，the 10 isolates of Proteus mirabilis were also found carrying CMY-2 gene.ClassⅠintegrons were amplified from 19 strains carrying gene cassettes″aac A4+cml A1″，″dfr A12+orf F+aad A2″and″dfr A32+ere A+aad A2″respectively.PFGE analysis revealed that the 20 isolates were grouped into 11 PFGE types P1-P11，the 12 isolates of P1-P3 were same clones.The sensitive rates of the isolates to Meropenem，Amikacin，Aztreonam，Ceftazidime and Tazocin were high.ConclusionNosocomial transmission of the same clone of Proteus mirabilis was appeared in the ward of neurology department of our hospital.The predominance drug-resistance genes were CTX-M-14 andCMY-2.The incidence of carrying classⅠintegrons was high，and the major gene cassettes were″aac A4 +cml A1″and″dfr A12+orf F+aad A2″.The 20 isolates were all sensitive to Meropenem，Amikacin and Aztreonam.Other Clinical departments should also pay attention to the nosocomial infection caused by Proteus mirabilis and strengthen the infection control measures.

Proteus mirabilis； drug resistance gene； integron； pulsed-field gel electrophoresis

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.003

A

1673-4130（2015）17-2461-03

2015-04-14）

南京军区医药卫生科研项目（11 MA118）；南京军区医学科学技术研究项目（06MA149）。 作者简介：冯福英，女，副主任医师，主要从事临床微生物学与检验的研究。