大肠埃希菌sdi A基因缺失株的建立*

伍彬宁，蔡壬辛，曾建明，鄂顺梅，李有强，叶大柠，鲁 洋，陈 茶

（广州中医药大学第二临床医学院检验医学部，广东广州 510006）

大肠埃希菌sdi A基因缺失株的建立*

伍彬宁，蔡壬辛#，曾建明，鄂顺梅，李有强，叶大柠，鲁 洋，陈 茶△

（广州中医药大学第二临床医学院检验医学部，广东广州 510006）

目的为研究HSL信号分子对大肠埃希氏菌的影响而建立大肠埃希菌sdi A基因缺失株。方法通过Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113和SM10λpir的sdiA基因，PCR测序鉴定；不同时间点检测A600值，绘制细菌生长曲线；荧光定量PCR检测csg D、csg B基因水平。结果PCR测序结果经DNAman软件比对分析，与预想结果一致；与野生株相比，sdiA基因突变对细菌生长曲线无明显影响。结论成功建立BW25113、SM10λpir的sdi A基因缺失株，为后续研究铜绿假单胞菌信号分子HSL对大肠埃希菌的影响奠定了基础。

大肠埃希菌； 基因敲除； Red重组系统； sdi A基因； HSL信号分子； 接合反应

铜绿假单胞菌（PA）是临床常见的条件致病菌，近年来，PA耐药问题日益严重。目前认为基因水平转移是介导细菌耐药的重要途径，其方式有：转化、转导和接合。接合介导的耐药基因水平转移是PA多重耐药的重要原因，但PA接合的调控机制尚不清楚。有研究证明Ti质粒在根癌土壤杆菌结合转移过程中受到一种由细菌释放，称为接合因子的信号分子的调控。接合因子实质上是一种酰基高丝氨酸内酯（HSL）分子，能提高Ti质粒转移的频率［1-2］。目前，有研究证实PA等革兰阴性菌广泛存在“群体感应”系统。在“群体感应”系统中，HSL分子作为自诱导剂来监测群体密度［3］。当细菌达到一定数量后，HSL浓度升高到一定阀值，启动一系列基因的表达，调节细菌的群体行为，如：PA胞外酶的产生、发光菌的生物发光性、Ti质粒的接合转移、细菌抗生素的合成、毒性因子的表达、生物膜的形成等。课题组前期在国家自然科学基金资助下研究PA信号分子HSL对大肠埃希菌（E.coli）-PA接合反应的影响，结果发现HSL有促进接合反应，并引起接合相关基因tra I、traG和trbC表达增高的作用。研究发现，转录因子sdi A是供体菌E.coli中唯一的HSL受体蛋白，为明确sdi A在接合中的作用，本文通过基因同源重组技术突变供体菌E.coli SM10λpir的sdiA基因，为后续研究HSL信号分子对E.coli-PA接合体系的影响打下基础。

1 材料方法

1.1 材料 BW25113菌株和基因敲除所用质粒［4］：p KD3、p KD46、pCP20由Barry L.Wanner教授惠赠，见表1。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 sdiA基因突变所用引物D-sdiA_F/R引物序列参考文献［5］进行设计，另外按NCBI数据库中E.coli基因组序列（登录编号：NC_000913.2）设计测序引物C-sdi A_F/ R，见表2。

1.2.2 基因敲除 本试验通过Red重组技术敲除E.coli SM10λpir的sdiA基因［4］。以p KD3质粒为模板，引物D-sdi A _F/R扩增重组同源DNA，纯化后电转化SM10λpir（p KD46）感受态，筛选氯霉素抗性克隆，42℃培养消除p KD46质粒后转化pCP20质粒，再次42℃培养消除氯霉素抗性及pCP20质粒，获得候选菌株用于后续试验鉴定。

1.2.3 测序鉴定 以引物C-sdiA_F/R扩增候选菌株，PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳成像，同时送测序，测序结果用DNAman软件比对分析。

1.2.4 荧光定量PCR（qPCR） 挑取单个SM10λpir野生株及sdiA突变株菌落至3 m L LB培养液中，37℃、200 r/min摇菌过夜，按1∶100比例稀释到新鲜LB培养基中，30℃、200 r/ min摇菌8 h，离心收集菌液提取RNA后通过SYBR Green染料法定量检测csg D和csg B基因表达，rpoD为内参基因，引物序列见表2。

1.2.5 生长曲线和细菌染色 从-80℃取E.coli SM10λpir sdi A基因突变株与野生株，接种血平板，挑取单克隆至3 m L LB液体培养基中37℃，200 r/min增菌12 h，取各菌液调0.5 MCF，再各取20μL至3 m L LB液体培养基中，37℃，200 r/ min，于0、2、4、6、8、10、12 h时，在721分光光度计测定菌液A600值，绘制生长曲线。同时进行常规制片，革兰染色，光学显微镜观察细菌形态并成像。

2 结 果

2.1 sdi A基因敲除的鉴定 因PCR鉴定引物在sdi A基因突变处上下游约200 bp处，突变后染色体上残留一个FRT序列，所以PCR产物应为622 bp，而野生株则为1 169 bp。PCR产物电泳结果与预期一致，见图1。测序峰形图显示测序质量良好，结果比对正确，见图2（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。

2.2 细菌生长曲线 细菌生长曲线显示，E.coli SM10λpir sdi A基因突变株与野生株无明显差异；此外，细菌培养4 h和12 h时的革兰染色结果显示SM10λpir sdi A基因突变株与野生株无明显差异，提示sdiA突变对细菌表型无明显影响。见图3、4（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。

2.3 qPCR检测生物膜相关基因的变化［6］qPCR检测结果发现E.coli SM10λpir sdiA基因突变株csg D和csg B基因表达量明显高于野生株，提示csg D和csg B合成受sdi A蛋白影响，见图5。

3 讨 论

本课题组前期试验发现受体菌PAO1的HSL合成基因缺失将降低E.coli-PA接合反应频率，因转录因子sdi A是供体菌E.coli中唯一的HSL受体蛋白，为明确sdi A在接合中的作用，本研究对供体菌E.coli SM10λpir sdi A基因进行了靶向缺失突变。

Red同源重组是一种利用同源重组方法改变生物体某一内源基因的遗传学技术。它将靶基因突变位点左右各35～50 bp DNA片段连接到耐药基因（本实验为氯霉素CmR）两侧，导入细菌后，在p KD46质粒携带的λ噬菌体Red重组酶作用下，与染色体上靶基因发生同源重组，从而实现在基因水平上对目的基因的敲除、替换和突变等操作［4］。本研究以Red同源重组技术敲除sdi A基因，证实该技术是一种高效准确的基因突变技术。

首先，本研究通过PCR测序检测结果证实sdi A基因突变成功。其次，在细菌表型方面，sdi A基因高表达能够抑制生物膜成分curli形成。因刚果红能结合curli和纤维素，是检测curli形成的非特异性试验［6］；所以课题组尝试进行刚果红试验验证。然而结果发现SM10λpir和BW25113 sdi A基因突变株的刚果红试验结果与野生株间无明显差别（未在本文结果中描述），不能用于sdiA突变株表型鉴别。因此，本研究在基因水平上检测了curli形成相关基因csg D和csg B的表达。结果提示csg D、csg B基因在SM10λpir sdiA缺失株高表达，与文献报道一致，侧面说明试验菌株建立成功。

文献报道，E.coli细胞分裂需要ftsQ、fts A和ftsZ产物的参与，而转录因子sdiA能识别ftsQAZ基因簇启动子［7］，促进基因转录，并导致细菌分裂加速，形态上多为短杆状［8-9］。本实验通过细菌生长曲线和对延缓期、对数期（4、12 h）的细菌进行革兰染色，发现37℃下sdiA基因的缺失对E.coli SM10λpir菌株的生长曲线和形态无明显影响，与文献报道的在sdi A基因高表达的条件下，sdi A蛋白促进细菌分裂现象并不矛盾。

综上所述，本文成功建立E.coli sdi A基因缺失株，为后续研究PA信号分子HSL对大肠埃希菌的影响奠定了基础。

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and gene regulation by N-acyl-L-homoserine lactones［J］.Nature， 1993，362（6419）：446-448.

［3］Fuqua C，Greenberg EP.Listening in on bacteria：acyl-homoserine lactone signalling［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3（9）：685-695.

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Construction of The sdiA Gene Mutant in Escherichia coli Strains*

Wu Binning，Cai Renxin#，Zeng Jianming，E Shunmei，Li Youqiang，Ye Daning，Lu Yang，Chen Cha△

（Department of Laboratory Medicine，the Second Clinical Medical College of Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，Guangdong 510006，China）

ObjectiveTo build sdiA gene muants of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir strains.MethodsThe sdiA gene of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir were knocked out with Red recombination system.The mutants were detected by PCR technique，and the following sequencing results were analyzed through alignment by software DNAman.Growth curve of strains were assayed by detecting the A600 value at different time point.The csg D and csg B genes expression levels were detected by fluorescent quantitative PCR in SM10λpir sdi A mutant thereafter.ResultsPCR products electrophoresis showed a shorten fragment in mutants comparing to their parental strains BW25113 and SM10λpir，and it was confirmed by DNA sequencing.The growth curves and cells morphology in Gram stain were similar in both mutants and wild-type strains.The expression of csg D and csg B genes was higher in SM10λpir sdiA mutants than those in wild-type strain.ConclusionThe mutants of sdiA deletion of Escherichia coli BW25113 and SM10λpir were constructed successfully，and it will be the foundation for further research of the effects of the signal molecular HSL on Escherichia coli.

Escherichia coli； gene knockout； Red recombination system； sdi A gene； HSL signal molecular； conjugation reaction

10.3969/j.issn.1673-4130.2015.17.005

A

1673-4130（2015）17-2466-03

2015-04-28）

国家自然科学基金资助项目（81071397、81271909）；广东省自然科学基金资助项目（S2013010012970）。 作者简介：伍彬宁，男，硕士研究生在读，主要从事临床微生物学与检验的研究；蔡王辛，男，检验技师，主要从事临床微生物与检验的研究。#共同第一作者。

△通讯作者，Email：chencha906@163.com。