黄芩及其有效成分对细菌生物膜抑制作用研究进展

兰方宇，陈洪涛

（1.南宁市第八人民医院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学制药厂，广西 南宁 530022）

生物膜（biofilm，BF）是微生物（如细菌）被包裹在其自身分泌的多聚物中形成的一种特殊细胞群体结构［1］。生物膜将药物与细菌隔离形成屏障，抗生素不能充分进入到生物膜内将细菌杀灭，据美国国立卫生研究院的初步统计，80%的细菌性疾病与细菌生物膜有关［2］，菌膜病（菌膜引起的疾病）对人体的致病性主要表现在：一是菌膜释放浮游菌造成慢性感染急性发作；二是生物膜中包裹细菌的多聚糖基质会将细菌与机体免疫系统隔离开来，使特异性抗体、吞噬细胞等对细菌的攻击难以奏效，影响机体免疫功能而致病。临床上许多顽固性、难治性感染可能均与形成菌膜有关。目前应用于临床的抗菌药并不能有效清除细菌生物膜，还可诱导耐药性产生［3］。我国有丰富的中药资源，中药在防止感染性疾病方面有其独特的优势，能产生多方面的药理效应，且价格低廉，毒副作用小，在抗细菌生物膜方面有广阔的研究前景。黄芩具有清热燥湿、泻火解毒等作用，是中医临床常用品种之一，国内外学者对其进行了大量研究。黄芩主要含黄酮类化合物，包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷等40多种成分，其中黄芩苷、黄芩素等是其主要有效成分［4］，已有多项研究表明，黄芩有效成分对多种细菌有抑制作用，对细菌生物膜亦有一定的影响。本文就近年来黄芪及其有效成分对细菌生物膜抑制作用的研究情况综述如下。

1 对铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginose，Pa）生物膜的影响

铜绿假单胞菌是临床上获得性感染的重要条件致病菌，尤其是粘液型铜绿假单胞菌容易形成生物膜，生成生物膜后具备较高的耐药能力。谢林利等［5］研究发现，黄芩苷、黄芩素体外能抑制Pa对固体表面的粘附能力，显著抑制Pa生物膜的形成，还能破坏Pa已形成的早期和成熟期生物膜，对生物膜的破坏效果与阿奇霉素相似，且对Pa早期生物膜形成的抑制作用比对成熟生物膜的抑制作用强。王贵年等［6］实验发现，15.65 mg/L的黄芩苷对铜绿假单胞菌的生物膜的发育有明显的破坏作用，通过减少细菌对载体的粘附，抑制和清除PaBF，同时抑制新的BF生成，增加抗菌药物对BF的渗透性，是黄芩苷对细菌生物膜的主要作用机制。

黄芩与抗菌药联用还能产生协同作用。孔晋亮等［7］进行了黄芩水煎液对Pa生物膜清除作用的研究，发现单独使用黄芩水煎液对早期或成熟BF内的铜绿假单胞菌均没有抗菌活性，但与头孢他啶（CAZ）联用后，黄芩水煎液对早期或成熟BF都有较强的破坏作用，增强了CAZ对BF内细菌的清除作用，效果明显优于CAZ单独使用，具协同杀菌作用。菅凌燕等［8］进行了黄芩苷联合左氧氟沙星对Pa生物膜影响的实验研究，该研究主要针对粘液型铜绿假单胞菌，其可合成粘液状的胞外多糖藻酸盐，致病力强于非粘液型。结果显示，单独应用黄芩苷，可使PaBF藻酸盐含量减少，但差异不显著（P＞0.05），黄芩苷联合应用左氧氟沙星时，藻酸盐含量降低约78.5%，产生显著的协同抗菌效应，因此该项研究推测，黄芩苷可能通过加强左氧氟沙星对铜绿假单胞菌生物膜的降解，协同发挥抗菌作用。

以上几组试验研究均表明，黄芩有效成分对Pa没有明显的杀菌作用，但对Pa生物膜的形成有抑制作用，且抑制效果与14、15元环的大环内酯类相当，联用适当的抗菌药后，能协同发挥强大的抗菌作用。

2 对金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureu，S.a）生物膜的影响

金黄色葡萄球菌是引起临床上化脓性感染的常见革兰氏阳性致病菌，抗菌药的广泛应用，致使多重耐药的S.a及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检出率不断增高，细菌BF的形成，对细菌起着强有力的保护作用，是引起细菌耐药的一个主要因素。杜仲业等［9］进行了黄芩素对金黄色葡萄球菌生物膜抑制作用的体外研究，结果显示，黄芩素对MRSA和S.a的最小抑菌浓度（MIC）均为256 μg/ml，当黄芩素浓度≥32 μg/ml时，能抑制金黄色葡萄球菌3 d和7 d生物膜形成，但不存在浓度依赖性关系，低于该浓度的黄芩素不能抑制BF的形成。

黄莹莹等［10］研究发现黄芩素单独作用于金黄色葡萄球菌生物膜时，与空白组相比活菌计数无明显差异，但当其与左氧氟沙星联合作用后，活菌计数较空白组及左氧氟沙星组明显减少（P＜0.05），推测黄芩素具有增强左氧氟沙星对生物膜渗透及杀菌作用。蒙锦祥等［11］观察到，低于MIC的黄芩苷能破坏S.a已形成的BF，但不能杀灭细菌，与头孢唑啉合用后，BF内活菌计数较空白对照组减少，差异有统计学意义（P＜0.01），说明合用后，能加速破坏BF的结构，增强头孢唑啉的渗透及对细菌的清除作用，显示出协同杀菌作用。

陈强［12］观察了黄芩液对MRSA生物膜的作用，电镜扫描结果显示，当黄芩液浓度为2 048 μg/ml时，培养液中MRSA生物膜及活菌数明显减少，说明黄芩液对MRSA及其生物膜有抑制作用。

3 对念珠菌生物膜的影响

念珠菌是真菌的一种，条件致病性真菌以白色念珠菌常见，但近年来白色念珠菌的分离率有所下降，对氟康唑敏感性较低的非白色念珠菌分离率有所增高，尤其是光滑念珠菌对氟康唑的耐药率呈上升趋势［13］。念珠菌生物膜的形成可使其有效抵御抗真菌药物，而粘附是真菌在物体表面形成生物膜的第一步［14］。

汪长中等［15］的试验发现，2 000、200 μg/ml的黄芩苷对白念珠菌的早期粘附有明显抑制功能，即一定浓度的黄芩苷能通过影响白念珠菌的菌丝形成而抑制其生物膜的形成及其致病性。同时还发现，黄芩苷在2 000 μg/ml时只引起40%的溶血，而常用的抗真菌药两性霉素B在125 μg/ml时便发生了溶血，二者相比，黄芩苷具有较弱的细胞毒性，黄芩苷等有效成分对治疗白念珠菌生物膜感染疾病具有潜在临床价值。黄杉［16］在黄芩素体外抗真菌研究实验中也发现，4～32 μg/ml的黄芩素对白色念珠菌生物被膜的抑制率达70%，明显抑制念珠菌生物被膜的形成，其作用机制主要是黄芩素使作为白念珠菌重要毒力因子且在生物被膜形成中起重要作用的细胞表面疏水性值降低，此为黄芩素抑制白念珠菌生物被膜形成的分子机制之一。

汪长中等［17］还进行了黄芩苷对非白念珠菌生物膜抑制作用的研究，在非白念珠菌的早期粘附阶段，1 000 mg/L的黄芩苷对光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌等4种菌的粘附均有明显抑制功能，而初始的粘附是生物膜形成的先决条件，提示了黄芩苷对多种真菌生物膜的早期发育具有明显干预效应。

4 对大肠杆菌（escherichia coli）生物膜的影响

王坤［18］通过实验摸索，建立可靠的大肠杆菌细菌生物膜（BBF）模型，考察了注射用双黄连方中三味药材——金银花、连翘、黄芩不同提取部位对BBF形成的影响，发现黄芩的醇提部分对大肠杆菌的BBF的形成和抑制作用较强，而醇提部分的氯仿和正丁醇的萃取部分对大肠杆菌BBF的形成和抑制作用较明显，表明对BBF抑制作用明显的为其脂溶性较强的部分。牛俊瑞［19］进行了自制中药提取物、黄芩提取物单一用药以及二者分别与头孢他啶联合用药前后大肠杆菌生物膜内活菌数比较的实验，结果单一用药组、联合用药组与用药前相比，生物膜被破坏，细菌数量减少，用药前后活菌计数统计有显著性差异，联合用药组与单一用药组相比，活菌计数也明显减少，组间比较有统计学意义，证明了黄芩提取物可以破坏大肠杆菌生物膜，与头孢他啶联合用药后，可以增强杀菌效果，并且降低各自的用药剂量。

5 对其他细菌生物膜的影响

牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg）是非酵解糖的革兰氏阴性厌氧球杆菌，是慢性牙周炎最主要的致病菌之一。张广平［20］进行了黄芩苷对Pg生物膜的抑菌实验，结果32.25 mg/L的黄芩苷对Pg生物膜有明显的抑制和破坏，且作用与剂量成正比。黄芩苷对Pg生物膜的抑制作用可能是其抑制细菌粘附性的机制之一。

粪肠球菌主要以生物膜形式定植于根管中，是导致根管治疗失败的主要原因之一，付爽等［21］实验观察到，黄芩苷对粪肠球菌的最小抑菌浓度为2 mg/ml，最小杀菌浓度为4 mg/ml，浓度为8 mg/ml时对粪肠球菌生物膜有明显抑制作用。

温绍霞等［22］进行了黄芩素对肺炎克雷伯菌生长及生物膜形成能力影响的研究，结果显示，加入浓度为30 μg/ml黄芩素的试管，细菌形成生物膜的厚度明显较对照组薄，说明黄芩素能减弱肺炎克雷伯菌生物膜形成的能力。

另外官妍等［23］研究报道，黄芩苷对表皮葡萄球菌生物膜的粘附和代谢均无影响，说明黄芩苷不能抑制表皮葡球菌生物膜的形成。

6 展 望

广谱抗菌药的使用，导致了大量耐药菌株的出现，生物膜的生存方式增强了细菌对其不利因素的抵抗能力，使之能在恶劣环境中生存［24］。新抗生素的研究跟不上耐药菌株的形成速度，而中药在防治细菌生物膜引起的感染方面有其独特的优势。中药黄芩的有效成分黄酮类化合物具有多层次、多途径、多靶点的药理活性作用，且未见明显的毒副作用，值得进一步的研究开发［25］，而上述的种种研究也表明，黄芩及其有效成分既可抑制细菌生物膜的形成，又可与抗菌药联用增强抗感染能力，具有很高的研究价值。

通过文献检索发现，目前黄芩有效成分对多种细菌生物膜抑制的研究实验，基本上是停留在体外研究阶段，体外与体内的抗菌效果是否一致有待进一步研究，同时还可以加强黄芩与其他中药组成复方制剂，或者与抗菌药联用，通过药物间的相互作用达到增强效果这方面的研究，明确抑制生物膜的活性单体及其作用靶点。期望通过对黄芩抗菌作用的系列研究，建立一种模式，延伸到其他中药对细菌生物膜的抑制作用研究，从而更好地促使中药在这方面领域的开发，与分子生物学、细胞生物学等多学科共同发展，应对日趋严峻的细菌耐药问题的挑战。

［1］唐婳，刘国生，谢志雄，等.细菌生物膜的结构及形成机制研究进展［J］.氨基酸和生物资源，2006，28（3）：30.

［2］李睿明.抗感染治疗新靶点——细菌生物膜［J］.医学与哲学，2006，27（4）：42.

［3］陈铁柱，李晓声，曾文魁，等.细菌生物膜耐药机制的研究与进展［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（12）：2205.

［4］徐玉田.黄芩的化学成分及现代药理作用研究进展［J］.光明中医，2010，25（3）：544.

［5］谢林利，周密，陈勇川，等.黄芩苷、黄芩素抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的研究［J］. 中国药房，2010，21（39）：3651-3653.

［6］王贵年，范莹，王龙梓，等.黄芩苷对铜绿假单胞菌生物膜的影响［J］.医学研究杂志，2011，40（1）：131-132.

［7］孔晋亮，陈一强，闫萍，等.黄芩水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜清除作用的体外研究［J］.中华结核和呼吸杂志，2006，29（5）：347-348.

［8］菅凌燕，何晓静，于莹.黄芩苷联合左氧氟沙星对铜绿假单胞菌生物膜的影响及相关机制［J］.中国医院药学杂志，2012，32（14）：1097-1099.

［9］杜仲业，陈一强，孔晋亮，等.黄芩素对金黄色葡萄球菌生物膜抑制作用的体外研究［J］.中国现代医学杂志，2012，22（12）：19-22.

［10］黄莹莹，陈一强，孔晋亮，等.黄芩素联合左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌生物膜的体外作用［J］.中华医院感染学杂志，2013，23（10）：2264-2266.

［11］蒙锦祥，陈一强，孔晋亮，等.黄芩苷协同头孢唑啉对金黄色葡萄球菌生物膜的体外研究［J］.中国现代医药杂志，2012，14（12）：1-3.

［12］陈强.三黄烧伤灵对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜影响的实验研究［D］.呼和浩特：内蒙古大学，2014.

［13］沈银忠.光滑念珠菌临床分离株对氟康唑耐药的机制研究［D］.上海：复旦大学，2008.

［14］史文娜，孙淑娟.白念珠菌生物膜的研究［J］.生命的化学，2008，28（5）：658.

［15］汪长中，程惠娟，徐颖，等.黄芩苷体外抗白念珠菌生物膜作用的研究［J］.上海中医药杂志，2008，42（8）：78-80.

［16］黄杉.黄芩素抗白念珠菌的作用机制研究［D］.上海：第二军医大学，2009.

［17］汪长中，程惠娟，张雄飞，等.黄芩苷对非白念珠菌生物膜抑制作用的研究［J］.中国中药杂志，2010，35（5）：641.

［18］王坤.细菌生物膜的形成和研究注射用双黄连对细菌生物膜的影响［D］.长春：长春中医药大学，2009.

［19］牛俊瑞.自制中药破坏大肠杆菌生物膜提高头孢他啶作用的实验研究［D］.呼和浩特：内蒙古大学，2014.

［20］张广平.黄芩苷对牙龈卟啉单胞菌生物膜的抑菌实验研究［J］.中国现代药物应用，2011，5（14）：87-88.

［21］付爽，许颖，宁尚波，等.黄芩苷体外抑制粪肠球菌生物膜能力的研究［J］.中国微生态学杂志，2014，26（1）：35-36.

［22］温绍霞，武军驻.黄芩素对肺炎克雷伯菌生长及生物膜形成能力影响的研究［J］.检验医学与临床，2013，10（20）：2707.

［23］官妍，谢萌，汪长中，等.连翘苷和黄芩苷对表皮葡萄球菌生物膜抑制作用的研究［J］.中国微生态学杂志，2010，22（10）：886-893.

［24］宋志军，吴红，Michael Givskov，等.细菌生物膜与抗生素耐药［J］.自然科学进展，2003，13（10）：1017.

［25］高燕，顾振纶，蒋小岗，等.黄芩素药理学研究新进展［J］.时珍国医国药，2010，21（7）：1767.