椎间盘退变性疾病相关基因的研究进展

陈思进 廖歆 王倚天 杨欣建

椎间盘退变性疾病是骨科常见的疾病之一，也是引起腰痛的主要原因［1］，临床上约20%的下腰痛由椎间盘退变引起［2］。退变的椎间盘细胞内会发生一系列有害的生化改变，致使细胞外基质结构、生物力学载荷发生变化，进而诱发疼痛［3］。目前，上述椎间盘细胞内外生化改变的机制仍不明确，主要有基因遗传学说［4］、细胞因子学说［5］等。近年来，椎间盘退变性疾病的实验对象和研究方法的发展，促进了对椎间盘退变性疾病相关基因的研究，现作如下综述。

一、椎间盘退变研究的实验对象

病变椎间盘是大多数学者首选的实验组标本［6］，但由于伦理问题，难以收集对照组的正常椎间盘。胡明等［7］的研究中采用经伦理委员会同意的自然流产胎儿的椎间盘作为对照组。Zhao等［8］的研究中选择有严重临床表现、MRI证实为椎间盘退变、Pfirrmann分级为Ⅳ～Ⅴ级、切除术后HE 染色证实为退变、排除肿瘤和感染的标本纳入实验组，对照组样本则来自于腰椎爆裂骨折需融合取出椎间盘，既往影像学未见明显退变的患者。亦有学者采用动物模型进行研究。然而，自然流产的胎儿缺乏相应影像学分级支持，较难鉴别椎间盘是否已退变；应用动物模型虽摆脱了相关伦理问题，但是否真正能够反映人椎间盘的情况，仍需进一步验证。目前，多数学者采纳经影像学证实并分级的退变椎间盘及爆裂骨折后需融合取出的椎间盘。

二、椎间盘退变的研究方法

蔡利军等［9］采用免疫组化方法，标本冰冻后切片，聚丁二酸丁二醇酯（poly butylene succinate，PBS）冲洗，N，N－二丁基丙烯酰胺（N，N－dibutylacryla－mide，DBA）溶液对目标基因下游产物进行染色，以颜色深浅为标准，观察目标基因下游产物在实验组和对照组中的表达情况。部分学者应用逆转录－聚合酶链反应（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）法，提取间盘组织RNA，行PCR 扩增，后在琼脂糖凝胶电泳分离，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行灰度分析［10］。近年来，DNA 微阵列分析成为多数学者热门的研究方法，将标本按类别分类，与基因芯片相结合，快速检测标本的基因表达，再与GEO 数据中心的数据相比较，来显示过表达及未表达的基因，同时研究表达的基因蛋白相互之间可能存在的联系［11］。Zhang等［12］在DNA 微阵列的基础上，采取TSP（top－score pair）的方法，通过应用计算公式计算分数，来研究环境因素对基因成对表达的影响，并认为分数越高，成对表达的基因内在联系越紧密。免疫组化法虽简便易行，但此法研究目标基因较少，无法准确研究多基因内在间的联系；DNA 微阵列虽可快速检测过度表达基因，但成本过高成为此法不能普及的一个限制因素。

三、椎间盘退变的相关基因及可能机制

椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板这几个重要部分组成。其可能的营养途径主要有两种：①软骨终板下血管袢将绝大部分氧气及营养物质输送至软骨终板、椎间盘基质，最终到达内部的椎间盘细胞，此即终板途径；②少部分营养来源于纤维环外围的血管网，向内层渗透，传递营养，即纤维环途径［13，14］。任何一个环节中的相关基因表达出现问题都可能导致椎间盘发生退变。

（一）生长合成相关基因

椎间盘生长合成相关基因主要包括LIM 矿化蛋白－1（LIM mineralization protein－1，LMP－1）、Y染色体性别决定结构域转录因子9（Sox9）基因、转化生长因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）、类胰岛素样生长因子（insulin－like growth factor，IGF）和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的基因。

1．LIM 矿化蛋白－1（LMP－1）基因 LMP－1是一种主要在骨骼中表达的细胞内非分泌性骨诱导蛋白，能促进成骨细胞骨钙素的分泌及骨结节的形成，主要在骨的钙化阶段发挥作用，并在成骨细胞分化过程中起正调节作用［15］。LMP－1通过增加椎间盘细胞的透明样基质来维持椎间盘软骨。通过BMP介导LMP－1含量的上调，能够提高椎间盘内Ⅱ型胶原蛋白及蛋白多糖的含量，从而减缓椎间盘的退变。同时，LMP－1能上调BMP－2和BMP－7的表达，并增强其协同成骨作用。

2．Y 染色体性别决定结构域转录因子9（Sox9）基因 Sox9是合成Ⅱ型胶原蛋白的重要转录因子之一，能促使Ⅱ型胶原及软骨的发育，而Ⅱ型胶原是椎间盘基质内保持椎间盘结构、功能的重要物质。Sowa等［16］研究发现，Sox9在椎间盘退变患者内的表达明显低于对照组，且Ⅱ型胶原蛋白的含量亦低于对照组。

3．转化生长因子－β（TGF－β）基因 TGF－β是一类具有生长潜能的因子，可促进椎间盘的蛋白多糖合成以及Ⅱ型胶原的产生，从而稳定椎间盘结构。最新研究表明TGF－β超家族能够双向调节椎间盘，早期促进椎间盘的蛋白多糖合成以及Ⅱ型胶原的产生，晚期TGF－β1产生大量Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原，加重椎间盘的纤维化［17］。因此，早期TGF－β为椎间盘修复性基因，其中TGF－β1的作用最大，晚期则成为椎间盘退变的可能原因之一。

4．类胰岛素样生长因子（IGF）基因 IGF 亦称为生长激素介质，是生长激素产生生理作用过程中必需的一种活性蛋白多肽，包括IGF－1和IGF－2。其中IGF－1在椎间盘的生长中发挥重要作用。Urano等［18］研究表明，IGF－1的位点突变与脊柱退行性病变相关。该基因可促进细胞有丝分裂，促进软骨发育，对软骨的稳定与营养都起着重要作用。

5．骨形态发生蛋白（BMP）基因 BMP 是促使多组织发生重构的超家族生长因子，与椎间盘相关的有BMP－2、BMP－7等。有研究显示BMP－2 可正向调节相关基因的表达，从而促使椎间盘蛋白多糖及胶原的表达。BMP－7 可促使椎间盘中的髓核细胞进行有丝分裂，产生Ⅱ型胶原与黏多糖。Wei等［19］研究显示，在细胞凋亡的外环境中上调BMP－7，可使椎间盘内胶原及蛋白多糖含量相对稳定。

（二）椎间盘分解代谢相关基因

椎间盘分解代谢相关基因主要包括：程序化死亡5（programmed cell death 5，PDCD5）基因、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族、金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）家族、含血小板结合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）家族等。

1．程序化死亡5（PDCD5）基因 PDCD5是一个表达广泛的促凋亡分子，能够促进多种细胞的凋亡。蔡利军等［9］研究发现PDCD5在病变组中表达明显高于对照组。有研究表明PDCD5明显上调能够导致骨性关节炎软骨的凋亡退变，软骨基质丢失伴随软骨下骨增生，参与骨关节炎病理过程。与此同时，PDCD5协同FAS基因，参与细胞凋亡，也是导致椎间盘退变的可能机制之一［20］。

2．基质金属蛋白酶（MMP）家族 MMP超家族有多种亚型，其中最重要的为1～3亚型，主要作用为降解间盘内的Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖。而胶原的丧失是导致椎间盘退变的直接原因之一。MMP1 基因能够影响SNP 位点第1607鸟苷酸的序列，继而改变启动子活性，影响转录水平。与此同时，MMP1亦能降解蛋白黏多糖，使得椎间盘稳定性下降，引发退变。

3．金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）家族 TIMP 家族有3种亚型，其中椎间盘中可见前2种亚型表达。TIMP可与MMP等比结合形成非共价键，进而抑制MMP对细胞外基质的降解作用。肖斌等［21］研究发现，携带TIMP 等位基因TT 类型的人群患腰椎间盘退变的概率明显升高，TIMP－1的基因多态性与腰椎间盘退变发生明显相关。

4．含血小板结合蛋白基序（TSP）的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS）家族 ADAMTS家族是一类具有降解蛋白多糖能力的超家族蛋白酶，在正常组织中含量较少，主要参与机体的发育、老化、炎症等，其中ADAMTS－4、ADAMTS－5在椎间盘退变中起到重要的作用。ADAMTS－4可直接作用于亲水性氨基葡萄糖聚糖蛋白多糖，使其降解，而亲水性氨基葡萄糖聚糖蛋白多糖的降解被认为是椎间盘早期退变的标志。ADAMTS－5 功能与作用机制类似于ADAMTS－4，但与其他亚型不同的是具有C 段的凝血酶敏感蛋白重复结构，这一特殊结构能够使其定位于某些特殊组织的特定位置。

（三）骨质疏松相关基因

骨质疏松相关基因的代表为维生素D 受体（vitamin D receptor，VDR）基因。维生素D 是一种类固醇激素，与骨质疏松、骨关节炎等疾病的发生有着千丝万缕的联系。VDR有4个基因的位点，其多态性的基因位点分别对应限制性内切酶BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ的酶切位点［22］。Videman等［23］发现，在椎间盘组织中，后两个酶切位点（即FokⅠ、TaqⅠ）等维生素D 受体基因的表达与椎间盘退变相关，体现为椎间盘在磁共振T2加权像成低信号。

（四）结构相关基因

1．胶原基因 椎间盘纤维环胶原蛋白能够维持椎间盘的稳定性及韧性，胶原原因（collagen gene）主要包括Ⅰ型胶原（COL1A1）基 因、Ⅱ型胶原（COL2）基因、Ⅸ型胶原（COL9A1、COL9A2、COL9A3）基因以及Ⅺ型胶原（COL11A1、COL11A2）基因。

（1）Ⅰ型胶原（COL1A1）基因 Ⅰ型胶原广泛存在于椎间盘纤维环组织，在退变的髓核中也可发现。Kellgren－Lawrence评分法显示COL1A1基因TT 表型者椎间盘退变的发病率最高，属高危基因。

（2）Ⅱ型胶原（COL2）基因 Ⅱ型胶原占椎间盘软骨细胞外基质的近一半含量，是椎间盘稳定的关键性胶原，其含量的减少直接导致Ⅰ、Ⅱ型胶原比例的失调，造成椎间盘稳定性下降。

（3）Ⅸ型胶原（COL9A1、COL9A2、COL9A3）基因 三者共同编码Ⅸ型胶原，参与纤维环间胶原的桥接。其中COL9A2在椎间盘退变中起着重要的角色。Trp2等位基因（色氨酸的密码子）取代COL9A2基因上编码精氨酸的密码子后，Ⅸ型胶原蛋白的多肽链的结构发生改变，其相应的连接作用下降，导致椎间盘的承重及弹性下降，从而引发椎间盘退变。

（4）Ⅺ胶原基因（COL11A1、COL11A2） Ⅺ胶原含量较少，部分存在于髓核与纤维环中，且随着年龄的增加含量递减。Ⅺ胶原基因发生异常会增加椎间盘膨出的危险度［24］。

2．聚集蛋白多糖 聚集蛋白多糖（aggrecan，AGC）广泛存在于椎间盘基质中，对间盘结构的稳定性有着重要作用［25］。有研究显示AGC 基因存在可变数目串联重复片段的多态性，其多态性与椎间盘退变的严重程度以及多节段椎问盘退变相关［26］。

（五）炎症因子类基因

在椎间盘退变的过程中，始终存在着慢性炎症，各种炎症因子中以白细胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）及肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－alpha，TNF－α）最为热门。胡宝山等［27］研究显示IL－1β可上调基质金属蛋白酶的产生，从而降解蛋白多糖，同时IL－1β可直接降低人体痛阈，继而产生症状。TNF－α主要由单核－巨噬细胞分泌，其主要作用为抑制细胞增殖，促进细胞溶解。在退变的椎间盘中，TNF－α可促使炎症细胞释放溶解酶，产生细胞毒作用，同时促使成纤维细胞增殖，形成瘢痕。

四、存在的问题

椎间盘退变性疾病基因方面研究已成为近年来的研究热点，国内外对椎间盘退变性疾病的易感因素、可能机制、有效的早期生物学预防或治疗方面作了多方面的研究，有一部分研究也通过转化医学应用于临床。然而仍有许多问题有待解决，主要体现在以下几个方面。

（一）椎间盘退变机制尚未明确

虽然国内外学者已经在椎间盘方面作了许多研究，但仍没有一个达成共识的椎间盘退变机制。对椎间盘退变机制的探索始终是一个复杂而艰辛的过程，对其形成、营养、代谢的相关基因、细胞因子、环境都只有一个粗略的研究。各基因间的相互联系，椎间盘内渗透压环境的改变对细胞、结构有无影响以及各蛋白之间相互作用的途径都是未来研究的热点［3，28］。

（二）正常椎间盘标本无法有效获取

因伦理问题，正常的椎间盘标本往往无法有效获取。因此，正常对照组的缺乏对实验的真实性、有效性提出了挑战。代替对照组标本的多为爆裂骨折后患者术前影像学椎间盘信号未改变的椎间盘，然而急性应激状态，这些“正常”椎间盘的环境、蛋白、细胞炎症因子并不能确认是否发生了亚急性的改变或是否与正常椎间盘相类似。且良好的动物模型始终未能很好的建立，动物模型的椎间盘与正常人类椎间盘有着不小的差异，不具备很好的代表性。因此，良好的对照标本、适宜的模型都是未来值得深思和探索的方向。

（三）基因等生物治疗转化医学方面的困难

对于椎间盘退变性疾病的基因学治疗也是近年来的热点课题。基因治疗是通过将靶向基因通过直接注入或间接分离培养修饰后重新植入靶向器官来达到预防、治疗相关疾病。利用基因治疗方法，有利于早期从源头预防及控制疾病的发生，避免了严重的后果及并发症。目前有研究显示LMP－1基因重组蛋白在体内无明显活性，在应用LMP－1基因治疗时，需向靶细胞转染LMP－1 基因，从而刺激活性蛋白［29］。但基因治疗目前只属于理论及实验阶段，并未大规模临床应用，对于基因生物治疗其疗效如何，如何利用病毒载体携带目的基因，如何进行靶基因的转染，转染后如何判断是否产生具有活性蛋白，及是否会因基因改变而导致其他意想不到的并发症，这些都是目前基因在转化医学方面面临的挑战，也是今后发展的领域。

总之，目前椎间盘退变的基因学研究尚处在一个起始阶段，基因与环境共同影响着椎间盘的退变，如何探索好、利用好基因这一利器，更好的做到个体化治疗，仍是任重而道远。

［1］Hegewald AA，Ringe J，Sittinger M，et al．Regenerative treatment strategies in spinal surgery［J］．Front Biosci，2008，13：1507－1525．

［2］Dagenais S，Caro J，Haldeman S．A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationaly［J］．Spine J，2008，8（1）：8－20．

［3］Lapointe JM，Summers BA．Intervertebral disk disease with spinal cord penetration in a Yucatan pig［J］．Vet Pathol，2012，49（6）：1054－1056．

［4］白跃宏，俞红．腰椎间盘退变分子遗传学研究进展与转换医学应用［J］．转化医学杂志，2012，1（2）：104－110．

［5］李高峰，张绍昆，付长峰，等．细胞因子及基因治疗椎间盘退行性变的研究动态［J］．中国组织工程研究与临床康复，2009，13（2）：359－362．

［6］刘进．RNA 干扰技术及其在椎间盘退变研究中的应用［J］．四川医学，2009，30（9）：1477－1479．

［7］胡明，马远征，李大伟，等．上皮膜蛋白－1在人椎间盘髓核细胞中的表达［J］．实用骨科杂志，2012，18（3）：227－230．

［8］Zhao B，Yu Q，Li H，et al．Characterization of microRNA expression profiles in patients with intervertebral disc degeneration［J］．Int J Mol Med，2014，33（1）：43－50．

［9］蔡利军，吴军，师志云，等．PDCD5在退变椎间盘组织中的表达及临床意义［J］．宁夏医学杂志，2012，34（5）：398－400．

［10］Bertram H，Nerlich A，Omlor G，et al．Expression of TRAIL and the death receptors DR4 and DR5 correlates with progression of degeneration in human intervertebral disks［J］．Mod Pathol，2009，22（7）：895－905．

［11］Chen K，Wu D，Zhu X，et al．Gene expression profile analysis of human intervertebral disc degeneration［J］．Genet Mol Biol，2013，36（3）：448－454．

［12］Zhang W，Li X，Shang X，et al．Gene expression analysis in response to osmotic stimuli in the interver－tebral disc with DNA microarray［J］．Eur J Med Res，2013，18：62．

［13］Grunhagen T，Shirazi－Adl A，Fairbank JC，et al．Intervertebral disk nutrition：a review of factors influencing concentrations of nutrients and metabolites［J］．Orthop Clin North Am，2011，42（4）：465－477．

［14］Urban JP，Smith S，Fairbank JC．Nutrition of the intervertebral disc［J］．Spine（Phila Pa 1976），2004，29（23）：2700－2709．

［15］张宁，陈维善．LMP－1基因与椎间盘退变［J］．国际骨科学杂志，2008，29（4）：270－271．

［16］Sowa G，VadalàG，Studer R，et al．Characterization of intervertebral disc aging：longitudinal analysis of a rabbit model by magnetic resonance imaging，histology，and gene expression［J］．Spine（Phila Pa 1976），2008，33（17）：1821－1828．

［17］Singh K，Masuda K，Thonar EJ，et al．Age－related changes in the extracellular matrix of nucleus pulposus and anulus fibrosus of human intervertebral disc［J］．Spine（Phila Pa 1976），2009，34（1）：10－16．

［18］Urano T，Narusawa K，Shiraki M，et al．Association of a single nucleotide polymorphism in the insulin－like growth factor－1 receptor gene with spinal disc degeneration in postmenopausal Japanese women［J］．Spine（Phila Pa 1976），2008，33（11）：1256－1261．

［19］Wei A，Brisby H，Chung SA，et al．Bone morphogenetic protein－7 protects human intervertebral disc cellsinvitrofrom apoptosis［J］．Spine J，2008，8（3）：466－474．

［20］Cheng AX，Lou SQ，Zhou HW，et al．Expression of PDCD5，a novel apoptosis related protein，in human osteoarthritic cartilage［J］．Acta Pharmacol Sin，2004，25（5）：685－690．

［21］肖斌，田伟，赵丹慧，等．TIMP－1 666C＞T 单核苷酸多态性与腰椎间盘退变相关性分析［J］．中华医学杂志，2010，90（41）：2939－2942．

［22］Uitterlinden AG，FangY，Van Meurs JB，et al．Genetics and biology of vitamin D receptor polymorphisms［J］．Gene，2004，338（2）：143－156．

［23］Videman T，Battié MC，Ripatti S，et al．Determinants of the progression in lumbar degeneration：a 5－year follow－up study of adult male monozygotic twins［J］．Spine（Phila Pa 1976），2006，31（6）：671－678．

［24］Solovieva S，Lohiniva J，Leino Arjas P，et al．Intervertebral disc degeneration in relation to the COL9A3 and the IL－1βgene polymorphisms［J］．Eur Spine J，2006，15（5）：613－619．

［25］Roughley PJ，Alini M，Antoniou J．The role of proteoglycans in aging，degeneration and repair of the intervertebral disc［J］．Biochem Soc Trans，2002，30（6）：869－874．

［26］Cong L，Pang H，Xuan D，et al．Association between the expression of aggrecan and the distribution of aggrecan gene variable number of tandem repeats with symptomatic lumbar disc herniation in Chinese Han of Northern China［J］．Spine（Phila Pa 1976），2010，35（14）：1371－1376．

［27］胡宝山，芮钢，杨茂伟，等．白细胞介素－1β对椎间盘蛋白多糖代谢的影响［J］．临床和实验医学杂志，2008，7（1）：31－32．

［28］Hristova GI，Jarzem P，Ouellet JA，et al．Calcification in human intervertebral disc degeneration and scoliosis［J］．J Orthop Res，2011，29（12）：1888－1895．

［29］Boden SD．Biology of lumbar spine fusion and use of bone graft substitutes：present，future，and next generation［J］．Tissue Eng，2000，6（4）：383－399．