山楂果醋醋酸发酵工艺研究

王彦安，邱松山 ，王云芳，姜翠翠

(1．江苏科技大学环境与化学工程学院，江苏镇江212000;

2．广东石油化工学院果蔬加工与贮藏工程中心，广东茂名525000)

山楂(Crataegus spp．)是蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科山楂属植物，果实中主要含有黄酮类、低聚黄烷类、有机酸类、微量元素和有机胺类等活性成分［1］。研究表明，山楂具有抗氧化、调节血脂、调节免疫、抗菌等多种生理功能［2－4］。目前国内外山楂系列加工产品主要有罐头、糖制品、饮料及山楂糕、山楂片等，由于山楂鲜食味道酸涩，山楂饮料及发酵类产品较少［5］。近年来，各种果醋饮品的研究受到越来越多的重视，草莓醋［6］、柿子醋［7］、柑橘醋［8］等各种果醋饮品不断投入研发并投放市场。目前对山楂醋的研究［9－10］较少，市场上山楂果醋的品种也比较少，因此深加工发酵制备山楂果醋产品，使山楂果醋兼有食醋和山楂的保健功能，具有广阔的开发应用前景。笔者以山楂为材料，采用响应面法优化山楂醋的发酵工艺，解决山楂鲜果酸涩影响山楂醋品质的问题，获得营养、风味、口感和色泽俱佳的山楂果醋，从而为山楂果醋的进一步工业应用提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 原料及试剂。新鲜山楂由广东茂名信宜绿洲生态农业有限公司提供，采摘当天运抵实验室，分选清洗备用;高活性干酵母，安琪酵母有限公司产品;醋酸菌(沪酿1．01)，广东石油化工学院果蔬加工与贮藏工程中心实验室保存菌种;蔗糖为市售一级，葡萄糖、酵母膏为生化试剂;其他试剂为国产分析纯试剂。

1．1．2 仪器与设备。RX-700α糖度计，日本爱宕科学仪器有限公司;DA-650台式电子酒精度计，日本京都电子公司;DHP-9162电热恒温培养箱，深圳三利仪器;80-2电动离心机，常州澳华仪器有限公司;PHS-3D型pH仪，上海仪电科学仪器有限公司。

1．2 操作方法

1．2．1生产工艺。山楂→去核→打浆→酶解→澄清过滤→调糖与pH→巴氏杀菌→酒精发酵→醋酸发酵→过滤→调配→灌装→巴氏灭菌→检测→成品。

1．2．2 酵母活化。参考文献［11］的方法，称取3．0 g安琪活性干酵母，35～38℃条件下6%的糖水复水30 min，然后32℃条件下活化2 h备用。

1．2．3 醋酸菌种活化培养。参考文献［12］配制酵母膏1%、葡萄糖1%、碳酸钙1%的醋酸菌活化培养基，加热溶解、灭菌，冷却后加入2%的95%乙醇。无菌条件下将醋酸菌种接入醋酸菌活化培养基200 ml/1 000 ml三角瓶中，32℃恒温培养24 h，备用。

1．2．4 酶解。成熟完好的山楂清洗去核后与凉开水按质量比1∶4 g/ml混合打浆榨汁，加热至90℃保持10 min。冷却后添加果汁液总量1%的果胶酶和1%的纤维素酶，45℃水浴酶解3 h。过滤后分装于250 ml三角瓶中80℃巴氏灭菌10 min。

1．2．5 酒精发酵。参考文献［13－14］经灭菌的果汁接种5%的酵母活化液，糖度调至18%，pH为3．5，温度保持30℃进行酒精发酵，定期测定酒精度变化，酒精度不再变化时停止发酵，此时发酵液的酒精度为7．3% ～7．4%。

1．2．6 醋酸发酵。发酵后的酒液中酒精度调至4% ～12%，按接种量为6%～14%接种醋酸菌活化液，温度控制在26～34℃的范围内进行单因素试验。单因素试验中，初始酒精度分别为4%、6%、8%、10%、12%，接种量分别为6%、8%、10%、12%、14%，发酵温度分别为 26、28、30、32、34 ℃。

1．2．7 调配与灭菌。以硅藻土为过滤介质，搅拌、静置、抽滤，直至形成0．5～1．0 cm的滤层且无明显浑浊时，收集滤液，测定生成醋酸和可溶性固形物的含量，并用山楂果汁、蜂蜜、白糖调配成口感良好、风味独特的山楂果醋饮料，巴氏灭菌后静置陈酿一段时间［15］，经检验合格即为成品。

1．2．8 醋酸发酵试验优化。根据单因素试验得到的优化发酵条件，采用Box-Behnken方法进行试验设计，选取接种量、初始酒精度、发酵温度作为考察因素，以+1、0、－1代表高、中、低水平，以发酵后山楂果醋的产酸量为响应值(Y，g/L)，设计3因素3水平共15个试验点的响应面分析试验。

表1 Box-Behnken试验设计的因素及水平

1．3 测定方法 pH采用PHS-3D型pH仪测定;可溶性固形物的含量采用RX-700α糖度计测定;酒精度采用DA-650台式电子酒精计测定;醋酸含量采用NaOH滴定法测定;感官质量采用感官评定法;还原糖的含量采用直接滴定法［16］测定;VC的含量采用2，6-二氯靛酚法测定;细菌总数采用GB/T4789．2－2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》规定的方法测定;大肠菌群采用GB/T4789．3－2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》规定的方法测定。

1．4 数据处理 应用Microsoft Office Excel 2003进行单因素试验数据处理，Design-Expert 8．06软件进行响应面数据优化处理。

2 结果与分析

2．1 醋酸发酵单因素试验

2．1．1 醋酸发酵中初始酒精度的影响。由图1可知，产酸量随着初始酒精度的升高而增大，当初始酒精度为8%时产酸量达到最大，之后初始酒精度升高产酸量反而缓慢下降。初始酒精度为8%时，发酵液的产酸量是51．40 g/L，因此选择发酵初始酒精度为8%。酒精度太低或太高都会限制醋酸菌的生长繁殖从而抑制醋酸发酵。

2．1．2 醋酸发酵中接种量的影响。由图2可知，产酸量随着接种量的增加而增大，当接种量为10%时产酸量达到最大，之后接种量升高产酸量反而缓慢下降。接种量为10%时，发酵液的产酸量是52．30 g/L，因此选择接种量为10%。醋酸菌接种太多使菌种生长受到限制，而接种太少则导致菌种生长过盛从而抑制醋酸发酵。

2．1．3 醋酸发酵中发酵温度的影响。由图3可知，产酸量随着发酵温度的增加而增大，当发酵温度为30℃时产酸量达到最大，之后发酵温度升高产酸量反而缓慢下降。发酵温度为30℃时，发酵液的产酸量是51．90 g/L，因此选择发酵温度为30℃。

2．2 醋酸发酵的响应面试验 醋酸发酵的响应面试验结果如表2所示。采用Design-Expert软件对试验结果进行回归分析，得到响应值为Y值(产酸量，g/L)，自变量为接种量(X1，%)、初始酒精度(X2，%)、发酵温度(X3，℃)的多元二次回归方程:Y= －819．121 25+22．042 92 ×X1+23．145 56

回归模型方差分析显示，F模型=43．98，P模型=0．000 3＊＊;

表2 Box-Behnken试验结果分析

2．2．1 响应面的交互效应分析。由图4(a)可知，接种量固定时，初始酒精度的升高使产酸量先增加后下降，随着接种量的变化，初始酒精度对产酸量的影响发生较大变化;初始酒精度固定时，接种量的增加使产酸量先增加后下降，随着初始酒精度的变化，接种量对产酸量的影响变化较大。因此接种量与初始酒精度的交互作用对产酸量的影响极显著，这与方差分析中X1X2的交互效应极显著一致。

由图4(b)可知，发酵温度固定时，产酸量随着接种量的增加先增加再下降，随着发酵温度的变化，接种量对产酸量的影响趋势保持一致;接种量固定量，发酵温度的升高使产酸量先增大后下降，随着接种量的变化，发酵温度对产酸量的影响趋势保持一致。因此接种量与温度的交互效应对产酸量的影响不显著，这与方差分析中X1X3的交互效应不显著一致。

由图4(c)可知，发酵温度固定时，初始酒精度的升高使产酸量呈先增加后下降的趋势，随着发酵温度的变化，初始酒精度对产酸量的影响趋势不变;初始酒精度固定时，发酵温度的升高使醋酸产量先增加后减小，随着初始酒精度的变化，发酵温度影响产酸量的趋势保持一致。可见，初始酒精度与发酵温度的交互作用对产酸量的影响不显著，这与方差分析中X2X3的交互效应不显著一致。

2．2．2 响应面模型验证。采用Design-Expert软件优化分析试验结果，山楂醋发酵试验的最佳工艺参数为:接种量10．01%、初始酒精度7．38%、发酵温度为29．74 ℃时，理论产酸量52．05 g/L，为了便于试验操作，山楂醋发酵的最佳工艺参数简化为:接种量10%、初始酒精度7%、发酵温度为30℃，该条件下山楂醋的理论产酸量为51．77 g/L。根据优化的最佳发酵条件(接种量10%、初始酒精度7%、发酵温度为30℃)进行3次重复检验试验，测得果醋产酸量均值51．76 g/L，与理论值(51．77 g/L)的相对误差小，表明响应面法优化设计获得的发酵工艺条件可信。

采用此工艺得到的山楂果醋产品呈亮红色，无悬浮物和沉淀，酸甜柔和，具有浓郁的山楂果香。总酸(以醋酸计):51．80 g/L;可溶性固形物:7．10%;还原糖(以葡萄糖计):2．75 g/L;VC:869．0 mg/L。细菌总数 ＜100 CFU/ml;大肠菌群、致病菌:未检出。

3 结论

该研究确定了最佳的山楂醋发酵工艺，醋酸发酵最佳工艺条件为:接种量10%、初始酒精度7%、发酵温度为30℃，该工艺下醋酸产量51．77 g/L。研究采用Box-Behnken试验优化果醋发酵，建立关于接种量、初始酒精度、发酵温度对产酸量的回归方程:Y=-819．121 25+22．042 92×X1+23．145 56 ×X2+45．423 75 × X3-0．469 17 × X1× X2-0．039 375 × X1× X3+0．077 500 ×X2×X3-0．869 27 ×X12-1．405 37 × X22-0．766 77×X32。响应面试验中单因素作用和双因素交互作用对果醋产量的影响体现为:接种量与初始酒精度的交互作用对醋酸的影响极显著(P＜0．01)，接种量与发酵温度的交互作用对醋酸的影响不显著(P＞0．05)，初始酒精度与发酵温度的交互作用对醋酸的影响不显著(P＞0．05)。

［1］柳唐镜，张棵，刘国英，等．中国山楂属植物资源研究和利用现状［J］．南方农业学报，2011，42(8):847-852．

［2］WENL R，GUOX B，LIURH，et al．Phenolic contents and cellular antioxidant activity of Chinesehawthorn“Crataeguspinnatifida”［J］．Food chemistry，2015，186:54-62．

［3］LI L Z，GAO P Y，SONG SJ，et al．Monoterpenes and flavones from the leaves of Crataegus pinnatifida with anticoagulant activities［J］．Journal of functional foods，2015，12:237-245．

［4］ZHU R G，SUN Y D，LI T P，et al．Comparative effects of hawthorn(Crataegus pinnatifida Bunge)pectin and pectin hydrolyzates on the cholesterol homeostasis of hamsters fed high-cholesterol diets［J］．Chemico-biological interactions，2015，238:42-47．

［5］赵二劳，李满秀．山楂的功能特性及其在食品工业中的应用［J］．食品研究与开发，2006，27(9):149-151．

［6］UBEDA C，CALLEJÓN RM，TRONCOSOA M，et al．A comparative study on aromatic profiles of strawberry vinegars obtained using different conditions in the production process［J］．Food chemistry，2016，192:1051-1059．

［7］徐辉艳．柿子保健果醋发酵工艺条件的研究［J］．农产品加工，2015(6):43-44，47．

［8］陈婷婷，刘青娥．柑橘果醋酿造工艺研究新进展［J］．安徽农业科学，2015(10):269-270．

［9］张新荣，严开银，武朝霞，等．山楂果醋饮料的制作工艺［J］．农产品加工(创新版)，2011(11):51-54．

［10］吴红艳．液态发酵法制备山楂果醋的研究［J］．食品工业，2007(5):33-35．

［11］宋慧，马利华，陈学红，等．山楂复合果醋发酵工艺的研究［J］．食品工业科技，2014，35(23):95-99，106．

［12］郑晓吉，李宝坤，史学伟，等．液体深层发酵蟠桃果醋工艺研究［J］．中国酿造，2013，32(1):161-164．

［13］曲芬霞，潘中田，吴桂容，等．桂东野山楂酒发酵工艺研究［J］．中国酿造，2011(7):94-96．

［14］何义，李宁，淑英．山楂酒饮料的加工工艺［J］．食品研究与开发，2015(3):9-13．

［15］周帼萍，汪芳安，王秀艳，等．双酶水解酿制柑桔果醋的研究［J］．食品科学，2007，28(1):215-218．

［16］郭新光，马佩选，王晓红，等．葡萄酒、果酒通用分析方法:GB/T15038-2006［S］．北京:中国标准出版社，2007．