miR－155下调心肌细胞ATR1α表达改善心肌细胞肥大＊

杨 勇，周 勇，曹 政，吴瑞霞，佟新竹，谢华强

（湖北医药学院附属十堰市太和医院：1.心血管内科；2.肿瘤内科 442000）

心肌肥大是老年患者充血性心力衰竭的重要病理生理过程之一，心肌肥大的过程包括心肌细胞体积的增大和蛋白合成的增加。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）主要与AngⅡ1型受体（AT1R）结合后激活心肌肥大的过程，AT1R过表达也与心肌肥大关系密切［1］。微小RNA（microRNA，miR）是一类19～25个碱基内源性、具有高度保守性的非编码RNA序列［2］。研究证实，多个 miR（miR－let－7a、miR－21、miR－22、miR－208、miR－206等）均参与了心肌肥大的发生、发展过程的不同环节［3］。miR－155是一个多功能 miR，在肺、心脏及肾脏表达较丰富［4］。Blanco等［5］观察到miR－155低表达与心肌肥大及心力衰竭的风险显著升高相关；Zheng等［6］则发现miR－155能够和细胞内源性AT1RmRNA结合，抑制蛋白的翻译，明显降低AT1R的表达水平。心肌细胞有丰富的AT1R的表达，且在啮齿类动物的心脏组织主要分布和表达的为AT1R的α亚型（ATR1α）［7］。因此本研究推测 miR－155可能通过对心肌细胞ATR1α表达的调控进而调节心肌肥大的发生。本研究拟观察miR－155表达对大鼠心肌细胞肥大的影响以及对ATR1α表达的影响，以探讨miR－155作为心肌细胞肥大的调控靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠心肌细胞株H9C2（2－1）由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。LipofectamineTM2000（Invitrogen公司，美国）、mirVana PARISTM Kit（Ambion公司，美国）由王汉琴博士惠赠；Trizol试剂（Invitrogen公司，美国）；Platinum SYBRGreen qPCR SuperMix－UDG（Invitrogen Biotechnology中国公司）。AngⅡ（Sigma，美国）、兔抗 ATR1α多克隆抗体（ABCAM公司，英国）；兔抗CaN－β多克隆抗体、兔抗 NFATc－4抗体、兔抗β－actin多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG抗体（Bioworld Technology公司，美国）；miR－155RNA 模拟物（mimics）及抑制物（inhibitors）由上海市吉玛生物科技有限公司根据sanger miRNA数 据 库 的 miR－155序 列 5′－UUA AUG CUA AUU GUG AUA GGG GU－3′（编号：MIMAT 0030409）设计并合成miR－155mimics，上游序列为：5′－UUA AUG CUA AUU GUG AUA GGG GU－3′，下 游 序 列 为：5′－CCC UAU CAC AAU UAG CAU UAA UU－3′。miR－155inhibitors序列为5′－ACC CCU AUCA CAA UUA GCA UUA A－3′。

表1 miR－155和U6内参的RT及PCR引物序列

表2 RT－PCR各产物的引物序列

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞培养及实验分组 转染 miR－155mimics及inhibitors的心肌细胞在转染后24h加入1×10－7mol/L AngⅡ，继续作用48h后用于后续检测。实验分对照组，不加任何药物；AngⅡ组，加入 AngⅡ，终浓度为1×10－7mol/L，不进行转染；模拟物组，转染入 miR－155mimics 80nmol/L，miR－155抑制物组，转染入 miR－155inhibitor 80nmol/L；AngⅡ加模拟物组，转染入 miR－155mimics 80nmol/L并加入 AngⅡ，终浓度为1×10－7mol/L；AngⅡ加抑制物组，转染入 miR－155inhibitor 80nmol/L并加入 AngⅡ，终浓度为1×10－7mol/L。

1.2.2 心肌细胞转染、荧光检测 心肌细胞用含10%胎牛血清DMEM培养生长至融合后进行传代，用含10% 胎牛血清的DMEM调节细胞密度至1×108/L种细胞于6孔板中。培养心肌细胞生长48h至细胞融合达30%～50%后，换无血清培养液并使用脂质体2000转染miR－155mimics及inhibitors进入心肌细胞。激光共聚焦显微镜下使用蓝色激光激发FAM荧光（激发波长480nm，发射波长520nm），拍摄荧光图片和同一视野中明场细胞照片。

1.2.3 实时荧光定量PCR法检测心肌细胞 miR－155的表达 收集对照组、模拟物组、miR－155抑制物组细胞，按照mir－Vana PARISTM试剂盒说明书提取并分离小于100nt的小分子RNA。使用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，应用ABI 7300Real Time PCR System在48孔PCR反应模块中进行定量PCR检测miR－155表达水平，反应体系于50℃2min，95℃2min，95℃15s，然后60℃30s，共40次循环，最后20℃2min。以U6基因为内标基因，使用2－ΔΔCT法计算 miR－155表达量。逆转录及荧光定量PCR引物序列见表1。

1.2.4 细胞表面积检测 转染24h后，心肌细胞加AngⅡ继续作用48h，取有心肌细胞生长的盖玻片，用预冷的Hank′s液漂洗血清及杂质，再用4%多聚甲醛固定15min后晾干。在相差显微镜下拍照，采用Leica图像分析系统对心肌细胞进行计数并测量单个细胞直径，每孔取10个视野，每个视野约20个细胞。测量细胞表面积，取平均值。每组重复3次。

1.2.5 RT－PCR 法检测心肌肥大标记物 ANP、β－MHC 及ATR1αmRNA表达 细胞处理后，依据产品说明书用Trizol裂解；氯仿抽提；4℃，15 000r/min离心15min，上层无色液相用异丙醇沉淀，加入DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度计测定A衡量纯度（适当比值在1.6～2.0）。逆转录反应（RT）合成模板cDNA。聚合酶链反应后取PCR产物5μL在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像仪进行分析，结果以吸光度比值表示。各产物的PCR引物序列、片段长度、退火温度见表2。PCR 反应条件为 94 ℃、3min，94 ℃、30s，72℃、1min，循环35次，最后72℃ 延伸10min。

1.2.6 Westen bolt法检测心肌细胞的ATR1α表达 提取心肌细胞总蛋白，4，4－二羧基酸－2，2－二喹啉（BCA）法测定蛋白浓度，完毕后将其加入5%十二烷基环酸钠（SDS）加样缓冲液中煮沸5min，以使蛋白质样品变性，置于－80℃冻存备用。按每孔上样量50μg进行SDS－PAGE电泳，稳压冰浴电转至醋酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭1h，一抗孵育4℃过夜（ATR1α1∶500），TBST 洗涤后加入荧光的山羊抗兔IgG（1∶15 000）室温孵育1h，采用化学发光法于暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。将胶片进行扫描存档，Bio－Bad公司Quantity－One软件处理系统分析目标带的光密度值。蛋白表达量用目的蛋白/GAPDH的吸光度比值表示。

1.3 统计学处理 每组进行独立重复3次试验，用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。数据采用±s表示，两组之间比较使用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，后以Tukey′s post－test进行检验，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌细胞miR－155模拟物转染与miR－155表达水平 转染24h后，在激光共聚焦显微镜的蓝光激发状态下，可见绿色荧光在视野下成簇分布（图1B）。与同一视野下明场细胞照片（图1A）进行融合后发现绿色荧光主要分布在细胞质中（图1C）。证实miR－155模拟物通过脂质体转染方法成功转染入细胞内。实时荧光定量PCR显示，与AngⅡ组对比，AngⅡ加模拟物组心肌细胞miR－155水平明显升高达3～4倍［（3.58±0.06）vs.（1.00±0.02），P＜0.05］；AngⅡ加抑制物组心肌细胞 miR－155水平下降［（0.46±0.01）vs.（1.00±0.02），P＜0.05］。

图1 转染后心肌细胞荧光分布（荧光显微镜×400）

图2 各组心肌细胞图片（×200）

2.2 心肌细胞表面积改变与对照组相比，在AngⅡ作用下，AngⅡ组心肌细胞表面积出现扩大（P＜0.05）；而模拟物组与抑制物组，心肌细胞表面积仅有增加趋势，但无明显统计学意义（P＞0.05）；与AngⅡ组比较，转染 miR－155模拟物及 miR－155抑制物入心肌细胞后再给予刺激，AngⅡ加模拟物组心肌细胞表面积明显缩小（P＜0.05），见图2和图3。

图3 各组心肌细胞表面积比较

2.3 ATR1αmRNA和蛋白表达与对照组相比，模拟物组和miR－155抑制物组的ATR1αmRNA和蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与AngⅡ组对比，AngⅡ加模拟物组心肌细胞ATR1αmRNA和蛋白表达水平均下降（P＜0.05），见图4。

图4 各组细胞ATR1αmRNA和蛋白表达比较

2.4 心肌肥大标记物β－MHC及ANP mRNA表达与对照组相比，模拟物组和miR－155抑制物组的β－MHC mRNA表达水平无明显增加（P＞0.05）；与AngⅡ组相比，AngⅡ加模拟物组的β－MHC表达明显减少（P＜0.05）见图5、6。与对照组相比，模拟物组和miR－155抑制物组的ANP mRNA表达水平无明显增加（P＞0.05）；与AngⅡ组相比，AngⅡ加模拟物组的 ANP mRNA表达明显减少（P＜0.05）见图7、8。

图5 各组细胞β－MHC与GAPDH PCR条带密度比较

图6 各组细胞β－MHC相对表达量分析图

图7 各组细胞ANP与GAPDH PCR条带密度比较

图8 各组细胞ANP相对表达量分析图

3 讨 论

miR是一类内源性非蛋白编码的单链小分子RNA，能在转录后水平抑制靶基因的表达或翻译，可在不同生理和病理状态下调节心肌细胞的增殖、分化及凋亡，对机械重塑、心电重塑均有重要影响［8］。本研究使用实时荧光定量PCR方法成功检测出体外培养心肌细胞株的 miR－155表达；而在 miR－155 mimics转入心肌细胞后可明显观察到miR－155表达增加到基础水平的3～4倍，而miR－155inhibitors可有效抑制miR－155表达；提示使用miR－155合成物可成功调节细胞内miR－155的表达水平，为进一步研究miR－155对细胞的影响提供了条件。

miR－155过表达能够有效抑制AngⅡ诱导的肥大心肌细胞表面的ATR1α基因和蛋白的表达，心肌肥厚的相关基因ANP、β－MHC的表达明显减少，心肌细胞表面积也明显减少，提示miR－155过表达可能通过下调ATR1α表达进而达到改善心肌肥大的作用。Cheng等［9］通过miR－155过表达干预严重子痫患者的体外培养脐静脉内皮细胞，观察到miR－155过表达可明显下调AT1R基因和蛋白水平的表达；这与本研究观察结果是相似的。研究还发现，对于未给以AngⅡ刺激诱导的肥厚心肌细胞，miR－155过表达或者抑制表达均未表现出对ATR1α显著的调节作用，也未表现出显著的改变心肌细胞肥大标记物β－MHC、ANP表达及改变心肌细胞表面积的作用，提示miR－155对正常心肌细胞和肥大心肌细胞ATR1α、β－MHC、ANP基因的调控具有时间分布的差异。Lunde等［10］使用miR基因芯片方法检测主动脉缩窄心肌肥厚大鼠模型心肌中miR表达时发现在主动脉缩窄造模后的1～14d均不能检测出miR－155表达，在14d后心肌肥厚程度较明显时才能检测到miR－155表达，与本研究的推测一致；提示miR－155主要在心肌肥大的晚期调控中发挥作用。

Heymans等［11］、Seok等［12］发现 miR－155过表达可通过多种途径促进心肌肥大和心力衰竭发生，沉默miR－155则改善心肌肥大，与本研究的结果不一致。分析可能与miR对细胞功能的调节过程往往涉及多个信号通路，且多个miR参与其中，miR之间也存在调节网络，其调节受到多因素的调控［13］；而动物模型的差异导致不同信号通路的激活不同，得到不一致的结果，本研究组拟进一步在不同心肌肥厚的动物模型中验证miR－155对心肌肥厚的具体作用及探讨其涉及的调节通路。因此，通过本研究可证实miR－155能够有效抑制ATR1α基因和蛋白水平的表达，抑制由AngⅡ介导的心肌肥大。因此miR－155可作为高血压心肌肥大的调控靶点进一步进行深入的研究。

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