阿利吉仑对心力衰竭代谢重构的影响

罗时珂，周序锋，谢东明

(赣南医学院第一附属医院心内二科，江西赣州 341000)

阿利吉仑对心力衰竭代谢重构的影响

罗时珂，周序锋△，谢东明

(赣南医学院第一附属医院心内二科，江西赣州 341000)

目的 探讨直接肾素抑制剂阿利吉仑(AL)对心力衰竭大鼠心肌代谢重构的影响。方法 健康纯系雄性SD大鼠40只随机分为4组，每组10只，即对照组、异丙肾上腺素(ISO)组(采用腹腔内注射ISO复制慢性心力衰竭的动物模型)、贝那普利(BH)组(在给予BH的基础上建立ISO复制慢性心力衰竭的动物模型)和AL组(在给予AL的基础上建立ISO复制慢性心力衰竭的动物模型),干预时间4周。心脏超声检测检测各腔大小及心功能，HE染色光镜下观察大鼠心肌形态学改变，检测脏器指数变化，测定各组大鼠血浆肾素活性(PRA)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平，Western blot法测定大鼠心肌组织中金属蛋白酶(MMPs)、金属蛋白酶抑制因子(TIMP)的蛋白表达水平，测定MMPs/TIMPs比值。结果 与ISO组及BH组相比AL组大鼠心肌病理形态、左室大小、左室射血分数(LVEF)明显改善，PRA、AngⅡ水平及MMPs/TIMPs比值均降低(P<0．01)。结论 在慢性心力衰竭的进展过程中阿利吉仑由于能降低PRA，对肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的阻断作用更充分在改善心功能、抑制心室重构方面具有独特优势。

心力衰竭；金属蛋白酶类；阿利吉仑；肾素活性

近年来研究证实肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在参与心力衰竭的发生、发展中起重要作用，抑制RAAS系统的激活是治疗心力衰竭的重要途径，现阶段的药物治疗主要以血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)类药物来阻断RAAS系统从而达到改善心功能、抑制心室重构的目的[1-2],延缓心力衰竭的进程,但近年来发现ACEI、ARB均不能完全阻断RAAS系统，肾素作为RAAS系统的起始步骤，可通过直接抑制其活性而阻断RAAS系统，研究表明肾素活性(PRA)可损害心脑血管系统[3]，而阿利吉仑(Aliskiren,AL)作为直接肾素抑制剂从源头抑制肾素对RAAS系统的阻断更完全[4]，本实验就阿利吉仑在改善心力衰竭的代谢重构上做进一步的探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体质量150～200 g，赣南医学院动物实验中心提供，分为4组，每组10只，即对照组、异丙肾上腺素(ISO)(ISO组)、贝那普利(BH，BH组)和AL组。

1.2 主要药物及试剂 AL为瑞士诺华公司产品；BH为瑞士诺华公司产品；ISO为上海禾丰制药有限公司产品；血浆血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)、AngⅡ放射免疫分析盒为北京福瑞生物工程公司产品；辣根过氧化物酶标记的兔抗大鼠一抗金属蛋白酶(MMPs)、金属蛋白酶抑制因子(TIMP)由Santa Cruz公司提供；二抗(生物素化羊抗兔IgG)由北京中衫金桥生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 BH组给予含BH的混悬液灌胃，给药量5 mg·kg-1·d-1，同时腹腔注射ISO(2.5 mg·kg-1·d-1)连续30 d，AL组给予含AL的混悬液灌胃，给药量50 mg·kg-1·d-1，同时腹腔注射ISO(2.5 mg·kg-1·d-1)连续30 d，对照组给予等量生理盐水灌胃连续30 d，ISO组腹腔注射ISO(2.5 mg·kg-1·d-1)连续30 d。

1.3.2 心脏超声检查 大鼠以0.3%戊巴比妥钠溶液(10 mL/kg)腹腔注射麻醉后备皮，应用超声心动仪(西门子ACUSON Sequoia512)及5-12 MHz高频线控探头(西门子公司)进行超声检测,检测左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)、左室缩短分数(FS)。

1.3.3 心肌组织病理学检查 取大鼠左心室心尖部心肌，4%甲醛固定后常规切片，HE染色以备光镜下观察；2.5%戊二醛固定后电镜下观察。

1.3.4 大鼠心脏指数测定 用预冷的生理盐水洗去心脏残留血液，剪去周围结缔组织和血管，滤纸吸干水分称量心脏湿质量。心脏指数=心脏湿质量/体质量。

1.3.5 大鼠血浆PRA、AngⅡ浓度的测定 处死大鼠后从其心脏取血，将其放入冰水中冷却的酶抑制剂抗凝管中(50 μL EDTA-2Na、50 μL 8-羟基喹啉、25 μL二硫基丙酸)摇匀放回冰水中冷却，将其放入离心机中离心，1 500 r/min，4 ℃离心5 min，吸出血浆，采用放射免疫法测定AngⅠ、AngⅡ，具体步骤参考说明书；血浆中PRA的测定以AngⅠ的生成率代替，具体步骤如下：取双份血浆分为对照管、测定管，对照管在4 ℃下测定AngⅠ浓度，测定管在37 ℃下温育30 min，测定AngⅠ浓度，AngⅠ生成率=(测定管浓度-对照管浓度)/温育时间。

1.3.6 Western blot检测 Western blot法测定大鼠心肌组织中MMPs、TIMP的蛋白表达水平，测定MMPs/TIMPs比值:以组织裂解液提取心肌组织总蛋白，蛋白定量BCA法测定蛋白总浓度后将样品稀释至同一浓度，各取含总蛋白量75 μg样本进行SDS-PAGE电泳，印记转染硝酸纤维素膜，常规漂洗、封闭过夜，次日将膜放入1∶500稀释的一抗中，室温下孵育2 h后，用TBST(含Tris-HCl、NaCl、Tween20 3种物质的缓冲液)在室温下摇床上洗3次，每次 10 min，在放入1∶1 000比例稀释二抗中，室温下孵育2 h后，用TBST在室温下摇床上洗3次，每次10 min，进行X光片曝光，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带。

2 结 果

2.1 各组大鼠二维超声心动图比较 与对照组相比，ISO组大鼠心脏的LVEDD明显变大，LVEF明显减退(P<0.01)。BH组、AL组较ISO组各项指标均显著改善(P<0.05)。与BH组相比，AL组各项指标均显著改善(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠二维超声心动图比较±s，n=10)

a：P<0.01，与对照组比较；b：P<0.05，对ISO组比较；c：P<0.01，与BH组比较。

2.2 各组大鼠心肌病理切片比较 心脏组织学检测和结果：ISO组心脏表面偏暗，颜色暗紫；对照组心脏表面光滑，颜色红润。HE染色光镜下示：ISO组大鼠心肌细胞肥大，部分心肌细胞有嗜酸变性和(或)坏死，病变呈灶性或弥散性分布，主要位于左心室壁，部分大鼠心肌间质结缔组织增生，增生的结缔组织呈条索状；BH组心肌组织病理损伤明显轻于ISO组；与BH组相比，AL组心肌细胞水肿、肥大程度减轻，细胞形态接近于正常细胞；对照组心肌细胞大小正常，排列整齐，见图1。

A：对照组；B：ISO组；C：BH组；D：AL组。

图1 各组大鼠心肌病理切片(HE×100)

表2 4周末各组大鼠心脏指数、PRA、AngⅡ比较

a：P<0.01,与ISO组比较；b：P<0.01,与BH组比较。

2.3 各组大鼠心脏指数、PRA、AngⅡ比较 各组大鼠心脏质量等指数比较：对照组、BH组、AL组大鼠心脏指数、PRA、AngⅡ较ISO组明显降低(P<0.01)；与BH组相比，AL组大鼠心脏指数、PRA、AngⅡ明显降低(P<0.01)，见表2。

2.4 各组大鼠MMPs、TIMP及MMPs/TIMP比值 各组大鼠MMPs、TIMP及MMPs/TIMP比值比较：对照组、BH组、AL组大鼠MMPs、MMPs/TIMP较ISO组低(P<0.01)；与BH组相比，AL组大鼠MMPs、MMPs/TIMP明显降低(P<0.01)，见表3、图2。

表3 4周末各组大鼠MMPs、TIMP及MMPs/TIMP比值比较

a：P<0.01，与ISO组比较；b：P<0.01，与BH组比较。

图2 各组大鼠MMPs、TIMP浓度比较

3 讨 论

血液中儿茶酚胺水平的升高，可导致心肌收缩力增强，心率加快，外周血管收缩，在心力衰竭的早期阶段可部分代偿血流动力学的异常，但交感神经张力持续过度增高，可引起一系列的不良反应如：心肌代谢增加致血氧消耗明显增加，心肌β受体密度下调致心肌收缩力下降，外周血管的收缩致心脏后负荷过重，室壁应力增加和组织灌注不足，直接的心肌毒性作用，激活PAAS，进一步加重外周血管收缩及水钠潴留，最终引起心室的重构。

心室重构是心力衰竭发生、发展过程的重要环节,MMPs是一类对细胞外基质成分(ECM)有特异降解作用的蛋白水解酶，MMPs通过调节ECM的降解对抑制心室的重构具有重要作用[5-6]，TIMP是具有抑制MMPs活性的一组多功能因子家族,可与TIMP以1∶1的比例形成MMP-TIMP复合体，从而阻断MMP与底物结合，抑制MMP的活性，降低胶原的降解，随着左室扩大和功能障碍的发展,心肌MMPs 的表达水平呈时间依赖性增加,同时伴有细胞外基质结构和成分的改变,MMPs/TIMPs这一胶原降解系统比例失调可造成心肌中胶原合成降解代谢紊乱并导致心肌发生纤维化[7]，心力衰竭时血清中去甲肾上腺素、AngⅡ增加，导致重构心肌内MMPs的合成增多，导致心肌内MMPs和TIMPs的不平衡，即MMP活性增高，而TIMP活性却不增加，本实验结果显示ISO组MMPs/TIMPs比值明显高于对照组、BH组、AL组，与BH组相比，AL组心肌MMPs蛋白表达更低，MMPs/TIMPs比值下降，这与AL较BH更充分抑制PRA、AngⅡ水平有关[8-9]，相关研究证实[10]，AngⅡ从ACE经典途径生成仅占30%～40%，有60%～70%是从旁路生成，而ACEIS并不能抑制旁路生成的血管紧张素导致PRA、AngⅡ抑制的不充分，目前流行病学调查表明PRA、AngⅡ水平与心血管疾病密切相关，同时亦有研究表明高水平PRA的冠心病患者其心力衰竭发生的风险明显增加[11-12]，并且一些临床试验分析也表明在心力衰竭的患者中，高水平的PRA是患者死亡的重要独立预测指标[13-14]，其原因可能与ACEI使用后导致血浆的AngⅡ产生减少，受AngⅡ负反馈的影响，肾素的释放明显增加，PRA明显增加，本实验也证实阿利吉伦干预组大鼠的PRA、AngⅡ水平较BH组要明显降低(P<0.01)，血浆PRA、AngⅡ水平的升高最终导致心血管疾病明显增加。

AL组、BH组的心脏超声示LVEDD、LVESD明显小于ISO组，LVEF和FS高于ISO组，心肌的病理改变轻于ISO组，与BH组相比AL组大鼠在心室重构改善方面明显改善，上述结果显示BH、AL长期治疗可以改善左室重构和心功能，对心力衰竭具有良好的治疗作用，而AL在改善心室重构、心功能方面要优于BH。

综上所述，直接肾素抑制剂AL由于更充分抑制血浆PRA、AngⅡ水平，因此可能更加降低重构心肌内MMPs的合成，抑制心肌纤维化的发生，在抑制心室重构、改善心功能上能发挥重要作用。

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The effect of Aliskren on the treatment of metabolic remodelling of failing heart

LuoShike,ZhouXufeng△,XieDongming

(SecondDepartmentofCardiovascularMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalCollege,Ganzhou,Jiangxi341000,China)

Objective To explore the effect of Aliskren on the treatment of metabolic remodelling of failing heart.Methods 40 male SD rats were randomly divided into four groups,normal group,ISO damage group (it adopt celiac injection to copy the animal heart failure model),BH(Benazepril,BH) protect group (on the base of the animal heart failure model,we gave the BH to the rats in the form of intragastrically),AL(Alickiren,AL) protect group(on the base of the animal heart failure model,we gave the AL to the rats in the form of intragastrically),the intervention time was 4 weeks.Four weeks later,survival rates were compared,HE staining were used to evaluate inflammatory infiltration and the form of myocardial cell,the cardiac function tests were performed by Doppler echocardiography procedures and detected PRA,AngⅡ,heart weight/body weight ratio,the myocardial protein expression of MMPs and TIMP (Western blot)were determined,the result of MMPs/TIMPs was calculated.Results In the above the three groups,we can see the obese myocardial cell,the ISO group pathological myocardial injuries and hypertrophy were observed under light microscope;compared with the ISO group and BH group,the indexes (pathological myocardial,heart weight/body weight ratio,the chroma of PRA and AngⅡ) of AL group were significantly decreased (P<0.01).Conclusion In the developing process of chronic heart failure,Alickiren could decrease PRA and inhibit RAAS system sufficiently,and it has advantage in improving cardic function and inhibiting ventricular remodelling.

heart failure;metalloproteinases；Alickiren;plasma renin activity

罗时珂(1982-)，硕士，主治医师，主要从事结构性心脏病研究。△

，Tel:15879782065；E-mail:15879782065@163.com。

·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.21.003

R541.3

A

1671-8348(2015)21-2887-03

2015-01-11

2015-03-30)