AngⅡ及其受体阻滞剂对急性肺损伤大鼠肺泡液体清除的影响

邓 嘉，王 乐

(重庆市江北区中医院内一科 400020)

AngⅡ及其受体阻滞剂对急性肺损伤大鼠肺泡液体清除的影响

邓 嘉，王 乐

(重庆市江北区中医院内一科 400020)

目的 探讨内源性血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其1型(AT1)受体阻滞剂对脂多糖诱导急性肺损伤(ALI)大鼠肺泡液体清除的效应。方法 25只SD大鼠分为空白对照组、ALI组及ALI+ZD7155(AT1受体阻滞剂)组。ALI组又按作用时间分为2、4、6 h 3个亚组。10 mg/kg脂多糖(LPS)腹腔注射诱导ALI大鼠模型。10 mg/kg ZD7155于LPS注射前30 min经腹腔注射。每组或亚组各5只大鼠。观察肺组织病理学改变、肺湿质量/干质量(W/D)比值，ELISA测定血浆及肺组织中AngⅡ水平的变化。在肺泡液体清除(AFC)测定中,活杀25只SD大鼠取肺组织，分为空白对照组、阿米洛利组、ALI组、ALI+ ZD7155组、ALI+ZD7155+阿米洛利组。每组各5只大鼠肺。伊文思蓝(evans-blue)标记5%清蛋白法测定AFC。结果 ALI 4 h组肺组织W/D较空白对照组显著增加(P<0.01)，ZD7155干预后肺组织W/D较ALI 4 h组显著降低(P<0.05)。随LPS作用时间增加，ALI大鼠模型血浆及肺组织内AngⅡ浓度变化呈现时间依赖性逐渐升高，各时间点组间差异有统计学意义(P<0.05)。阿米洛利组与ALI 4 h模型组AFC均较空白对照组显著降低(P<0.01)，ALI 4 h组AFC高于阿米洛利组(P<0.05)；ALI+ZD7155组AFC高于ALI 4 h组(P<0.05)，但ALI+ZD7155+阿米洛利组AFC降低，与阿米洛利组差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AngⅡ减弱ALI大鼠AFC；其AT1受体阻滞剂可逆转此病理生理过程。

血管紧张素Ⅱ；急性肺损伤；上皮钠通道；肺泡液体清除

急性肺损伤(ALI)病死率高达50%～60%，其发病机制仍未完全阐明。目前研究认为促进肺泡液体清除(AFC)有助于改善ALI预后[1]。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)在局部肺组织中也有表达，在ALI中起调控炎症发生的作用，但对ALI AFC的影响如何尚不明确。本实验通过脂多糖(LPS)诱导ALI大鼠模型，观察Ang Ⅱ及其1型(AT1)受体阻滞剂对AFC的影响，探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁健康成年雄性SD大鼠50只，体质量(280±20)g(重庆医科大学动物实验中心)。LPS、阿米洛利、戊巴比妥、ZD7155(ATI受体阻滞剂)、伊文思蓝(evans-blue)、Ang Ⅱ ELISA检测试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) ELISA检测试剂盒均购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

1.2.1.1 ALI模型制备及药物干预分组 将25只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，仰卧固定。分为：(1)空白对照组：注射与LPS等量的生理盐水，作用时间4 h；(2)ALI组：注射LPS 10 mg/kg复制ALI模型，再根据按不同作用时间又分为2、4、6 h 3个亚组；(3)ALI+ ZD7155组：LPS注射前30 min注射10 mg/kg ZD7155，再注射10 mg/kg LPS作用4 h。各实验组或亚组大鼠均为5只。采集动脉血并制备血浆-20 ℃冻存，然后活杀大鼠取肺组织。

1.2.1.2 离体肺组织肺泡液体清除率测定的分组 (1)空白对照组:等量生理盐水注射作用大鼠4 h后，给予右下肺灌注液；(2)阿米洛利组：等量生理盐水注射作用4 h取肺后，向右下肺内滴入含1×10-3mol/L阿米洛利的灌注液；(3)ALI组：大鼠经LPS作用4 h后，给予右下肺灌注液；(4)ALI+ ZD7155组：大鼠经LPS作用4 h后，向右下肺内滴入含1×10-4mol/L ZD7155的灌注液；(5)ALI+ ZD7155+阿米洛利组：大鼠经LPS作用4 h后，向右下肺内滴入含1×10-4mol/L ZD7155和1×10-3mol/L阿米洛利的灌注液。每组大鼠均为5只。各组给予灌注液后再行机械通气1 h，抽取肺泡液体测定AFC。

1.2.2 肺湿质量/干质量(W/D)比值测定 游离大鼠左肺，称量湿质量(W)，然后80℃烤箱脱水72 h后再称量干质量(D)，计算W/D比值。W/D比值=(肺湿质量-肺干质量)/肺干质量。

1.2.3 病理形态学检查 各组或亚组大鼠在作用4 h后均取右肺下叶组织，放入10%甲醛溶液中固定48 h，石蜡包埋，苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察肺间质及肺泡病理学改变。

1.2.4 血清AngⅡ及TNF-α浓度测定 动脉血4 ℃ 3 000 r/min离心10 min取上清液，用ELISA分别测定血清AngⅡ及TNF-α浓度，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 肺组织AngⅡ浓度测定 将肺组织剪碎后与匀浆介质按1∶9比例混合，玻璃匀浆器使肺组织充分匀浆化，然后4 ℃ 3 000 r/min离心10 min取上清液，用酶联免疫分析法测定，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6 离体肺组织肺泡液体清除率的测定 将LPS或生理盐水作用4 h后的大鼠麻醉处死，气管切开后进行气管插管，取出全部气管、肺脏及心脏，用保鲜膜包被后放入38 ℃水浴箱中孵育。经气管导管将灌注液(0.15 mg/mL伊文思蓝标记的5%清蛋白等渗生理盐水)以4 mL/kg灌入大鼠右肺下叶，并给予2 mL的氧气确保灌注液到达肺脏。持续给予100%氧气，使气道压力在650～700 Pa，行机械通气1 h。然后以采样管吸取右肺下叶内的肺泡液体0.2 mL，通过分光光度仪，在620 nm处测定Evans蓝标记的清蛋白浓度，计算AFC。

2 结 果

2.1 肺组织病理变化 与正常肺组织(图1A，未见炎症细胞浸润，无间质水肿)相比，ALI组大鼠(图1B)肺组织肺泡完整性破坏，部分肺泡塌陷，肺间质增厚水肿明显，大量炎症细胞浸润。ALI+ZD7155组大鼠(图1C)肺泡结构较ALI组完整，部分肺泡复张，肺间质厚度明显减轻，炎症细胞浸润明显减少。

A：正常肺组织；B：ALI组；C：ALI+ZD7155组。

图1 各组大鼠肺组织HE染色结果 (×100)

2.2 肺组织W/D比值 ALI 4 h组肺组织含水量与空白对照组相比明显增加(P<0.01)；ALI+ZD7155组大鼠肺组织含水量较ALI 4 h组显著减少，但仍高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3 血清TNF-α浓度 ALI4 h模型组血清TNF-α浓度较对照组显著增加(P<0.01)；ZD7155干预ALI大鼠后血清TNF-α浓度较模型组显著降低(P<0.01)，见表1。

表1 AngⅡ对ALI大鼠血清TNF-α及肺组织W/D比值的影响

a：P<0.01，与对照组相比；b：P<0.01；c：P<0.05，与ALI组相比。

2.4 血浆及肺组织AngⅡ浓度变化 LPS诱导ALI大鼠模型血浆及肺组织内AngⅡ浓度变化呈现时间依赖性，随着LPS作用时间的延长呈进行性增加，各时间点组间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血浆及肺组织AngⅡ浓度变化

a：P<0.01，b：P<0.05，与空白对照组相比；c：P<0.05，与ALI 2 h组相比；d：P<0.01，e：P<0.05，与ALI 4 h组相比。

a：P<0.01，与空白对照组相比；b：P<0.05，与ALI组(4 h)相比；c：P<0.01，与ALI+ZD7155组相比；d：P<0.05，与阿米洛利组相比。

图2 ALI 4 h各组大鼠离体肺组织肺泡液体清除率比较

2.5 AFC变化 阿米洛利组较空白对照组AFC显著降低(P<0.01)。ALI组(4 h)AFC较空白对照组减少(P<0.01)，但仍高于阿米洛利组(P<0.05)。ALI+ZD7155组AFC高于ALI组(P<0.05)；ALI+ZD7155+阿米洛利组AFC降低，与阿米洛利组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.6 肺组织AngⅡ浓度与AFC变化的相关性分析 ALI 4 h大鼠肺组织AngⅡ浓度与AFC呈负相关(r=-0.895,P<0.05)。

3 讨 论

AngⅡ是肾素-血管紧张素系统(RAS)中最关键的效应物质。研究证实，AngⅡ在局部组织能通过自分泌和旁分泌方式发挥调节器官生理功能的作用[2]。AngⅡ浓度与ALI炎性介质的浓度显著相关，血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)抑制AngⅡ的生成后促炎细胞因子分泌显著减少[3]。进一步研究发现，AngⅡ主要通过其1型受体促使TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)等多种细胞因子生成，诱导或加重ALI的发生、展[4]。本实验结果说明，血清以及肺组织AngⅡ的浓度随LPS诱导ALI动物模型作用时间的延长而进行性增加，血清TNF-α浓度升高也与AngⅡ的诱导生成相关，同时特异性AT1受体阻滞剂抑制AngⅡ和TNF-α生成，提示AngⅡ通过AT1受体调节ALI炎症过程。

除诱导炎症作用之外，AngⅡ在肺水肿的发生发展中也扮演重要的作用。本实验中，ALI大鼠模型的病理结果显示肺泡水肿明显，且肺W/D比较对照组显著增加，而AT1受体阻滞剂干预后病理水肿及肺湿质量/干质量比结果均明显减少，肺水肿缓解。AngⅡ可以通过多种方式调节ALI肺水肿的形成。局部诱导生成的AngⅡ能促发肺血管的漏出增加[5]，而在AT1受体基因敲除鼠上这种作用显著减弱[6]，提示AngⅡ通过AT1受体途径促进肺血管通透性增加，加重肺水肿，与本研究结果相一致。AngⅡ还能显著下调ALI大鼠水通道蛋白1(AQP1)表达，促进肺水肿形成[7]。

在ALI肺水肿的发生中AngⅡ对肺泡液体清除的作用如何仍然不清楚。本实验结果显示，AngⅡ通过AT1受体减弱AFC，不利于肺泡液体清除；在阿米洛利同时作用下，AT1受体阻滞剂对AFC的升高作用被完全消除，并且与阿米洛利单独作用时的AFC相比较没有显著差异，提示AngⅡ通过AT1受体对AFC调节的作用通路与阿米洛利的的作用通路可能是一致的。阿米洛利是肺泡上皮钠通道(ENaC)的特异性阻断剂，后者被认为是肺泡内钠水重吸收的限速步骤[8]，阿米洛利能够显著降低ENaC对钠离子的转运力，从而影响肺泡内液体的重吸收。因此本实验提示AngⅡ对AFC的影响是通过对ENaC的调控实现的。其可能的机制为：多种组织的研究结果发现AngⅡ与AT1受体相互作用后能够介导细胞内环化腺核苷一磷酸(cAMP)浓度减少[9-11]。细胞内cAMP浓度变化能够调控ENaC全细胞电流，诱导顶膜侧钠通透性的快速增加[12]，cAMP浓度降低使阿米洛利敏感性ENaC肺液清除能力减弱；用β肾上腺能受体激动剂特布他林进行干预后，能升高细胞内cAMP浓度，从而增强阿米洛利敏感性短路电流，增加跨上皮钠电流[13]，改善AFC。

总之，AngⅡ通过AT1受体降低肺泡液体清除；运用AT1受体阻滞剂可以逆转上述病理生理过程，减轻肺水肿。

[1]Briot R,Frank JA,Uchida T,et al.Elevated levels of the receptor for advanced glycation end products,a marker of alveolar epithelial type I cell injury,predict impaired alveolar fluid clearance in isolated perfused human lungs[J].Chest,2009,135(2):269-275.

[2]Paul M，Poyan MA，Kreutz R．Physiology of local renin-angiotensin systems[J].Physiol Rev,2006,86(3):747-803．

[3]Hagiwara S,Iwasaka H,Matumoto S,et al.Effects of an angiotensin-converting enzyme inhibitor on the inflammatory response in in vivo and in vitro models[J].Crit Care Med,2009,37(2):626-633.

[4]Wang F,Xia ZF,Chen XL,et al.Angiotensin Ⅱ type-1 receptor antagonist attenuates LPS-induced acute lung injury[J].Cytokine,2009,48(3):246-253.

[5]Imai Y,Kuba K,Penninger JM.The discovery of angiotensin-converting enzyme 2 and its role in acute lung injury in mice[J].Exp Physiol,2008,93(5):543-548.

[6]Imai Y,Kuba K,Rao S,et al.Angiotensin-converting enzyme 2 protects from severe acute lung failure[J].Nature,2005,436(7047):112-116.

[7]曹春水,殷勤,黄亮,等.血管紧张素Ⅱ对急性肺损伤大鼠肺水通道蛋白1表达的影响[J].中国危重症急救医学,2010,22(7):426-429.

[8]Althaus M,Fronius M,Buch-Ckert Y,et al.Carbon monoxide rapidly impairs alveolar fluid clearance by inhibiting epithelial sodium channels[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2009,41(6):639-650.

[9]Saha S,Li Y,Anand-Srivastava MB.Reduced levels of cyclic AMP contribute to the enhanced oxidative stress in vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats[J].Can J Physiol Pharmacol,2008,86(4):190-198.

[10]Li XC,Carretero OA,Navar LG,et al.AT1 receptor-mediated accumulation of extracellular angiotensin Ⅱ in proximal tubule cells:role of cytoskeleton microtubules and tyrosine phosphatases[J].Am J Physiol Renal Physiol,2006,291(2):375-383.

[11]Jensen AM,Bae EH,Fenton RA,et al.Angiotensin Ⅱ regulates V2 receptor and pAQP2 during ureteral obstruction[J].Am J Physiol Renal Physiol,2009,296(1):127-134.

[12]Richards KS,Bommert K,Szabo G,et al.Differential expression of Na+/K+-ATPase alpha-subunits in mouse hippocampal interneurones and pyramidal cells[J].J Physiol,2007,585(2):491-505.

[13]Mutlu GM,Factor P.Alveolar epithelial beta2-adrenergic receptors[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2008,38(2):127-134.

Effect of angiotensin Ⅱ and Ang Ⅱ type 1 receptor antagonist on alveolar fluid clearance in rat with acute lung injury

DengJia,WangLe

(FirstDepartmentofInternalMedicine,TraditionalChineseMedicalHospitalofJiangbeiDistrict,Chongqing400020,China)

Objective To research the effect of angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) and Ang Ⅱ type 1 (AT1) receptor antagonist on alveolar fluid clearance (AFC) in rats with acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharides (LPS).Methods Twenty-five healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control group,ALI group and AT1 receptor blocker pretreatment group (ALI+ZD7155 group),with 5 rats in each group.The ALI group was further divided into three subgroups of observation at 2,4 and 6 hours.ALI model of rats was reproduced with intraperitoneal injection of LPS 10 mg/kg.ZD7155 10 mg/kg was injected intraperitoneally thirty minutes before administration of LPS.The pathological changes and ratio of wet to dry (W/D) weight of lung tissue were measured at various intervals.The level of Ang Ⅱ in serum and lung tissue was determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).In measurement of AFC,The twenty-five SD rats lungs were obtained and randomly divided into control group,amiloride group,ALI group,ALI+ZD7155 group and ALI+ZD7155+amiloride group,with 5 lungs of rats in each group.AFC was estimated by evans-blue labeled albumin.Results W/D weight of lung tissue was significantly increased in ALI group (P<0.01),but significantly decreased in ALI+ZD7155 group (P<0.05).LPS significantly increased concentration of Ang Ⅱ in serum and lung tissue in a time-dependent manner (P<0.05).Concentration of Ang Ⅱ in serum and lung tissue was significantly lower in ALI+ZD7155 group than in ALI group (P<0.05).AFC in amiloride group and ALI group was significantly decreased when compared with control group (P<0.01).However,AFC in ALI group was significantly higher than amiloride group (P<0.05).AFC in ALI+ZD7155 group was significantly increased compared with ALI group (P<0.05).There was no significant difference in AFC between ALI+ZD7155+amiloride group and amiloride group(P>0.05).Conclusion Ang Ⅱ attenuates AFC in rats with ALI,however,AT1 receptor antagonist could reverse the effect of Ang Ⅱ on AFC.

angiotensin Ⅱ;acute lung injury;epithelial sodium channel;alveolar fluid clearance

邓嘉(1981-)，博士，主治医师，主要从事呼吸及危重症医学研究。

·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.21.005

R563.8

A

1671-8348(2015)21-2895-03

2015-01-12

2015-03-26)