PGE2 在结核感染中对巨噬细胞凋亡的调控①

熊文景 温 茜 马 骊 (南方医科大学生物技术学院分子免疫学研究所，广州 510515)

1 PGE2

前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)是花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)在环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)作用下代谢形成的五大重要代谢产物之一，与其他四种产物PGF2α、PGD2、PGI 及血栓烷A2(Thromboxane，TXA2)被统称为前列腺素。

1.1 PGE2 合成代谢 PGE2 的合成源自细胞膜上的磷脂(Phospholipd)在磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)作用下转化生成游离AA 的过程［1］。游离AA 可经COX、脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)与细胞色素P450 单氧酶(Cytochrome P450 monooxygenase)三条通路进行代谢，其中，COX 途径所生成的产物即为PGE2［1］。

COX 家族有三个成员，其中参与PGE2 合成的主要是COX-1 与COX-2［2］，COX-1 组成性表达于所有组织细胞中，而COX-2 在炎症及癌症发生时表达上调。COX-3 表达于脑髓与脊髓中，其作用还有待进一步研究［3］。

COX-1、-2 作用于AA 后，首先形成的代谢物为前列腺素H2(Prosta-glandin，PGH2)，其在PGE2 合酶(PGE2 synthase，PGES)的催化作用下进一步转变为PGE2［4］。PGES 又包含三类，即胞质型PGE2 合酶(cytosolic PGES，cPGES)、膜结合型PGE2 合酶-1(microsomal PGES-1，mPGES-1)以 及 mPGES-2。cPGES 与mPGES-2 为组成性表达，而mPGES-1 属于参与类花生酸与谷胱甘肽(Glutathione，GSH)代谢的膜相关蛋白家族(Membrane-associated proteins involved in eicosanoid and GSH metabolism family，MAPEG family)成员，在炎症中表达升高，但在糖皮质激素的抗炎过程中下调。mPGES-1 在COX-2 催化AA 经由PGH2 生成PGE2 的过程中发挥关键作用［5］。

1.2 PGE2 与其受体 几乎所有的细胞都能产生PGE2。在炎症发生与发展过程中，PGE2 的最主要来源是病原菌感染的免疫细胞［6］。PGE2 通过调节这些免疫细胞的成熟、迁移以及细胞因子的分泌，从而调节机体的免疫应答。介导PGE2 各种生物学效应的是前列腺素受体(E prostanoid，EP)。

目前所知的PGE2 受体有EP1-EP4。其中，EP3与EP4 是PGE2 的高亲和性受体，接受较低水平的PGE2 刺激即可活化下游信号通路;而EP1 与EP2却需结合较高水平的PGE2 才能启动生物学效应［7-9］。EP 为膜相关的G 蛋白偶联受体，但EP1 与EP3 的激活并不需要通过cAMP。EP1 可增加胞内Ca2+浓度，而EP3 为结合Gi-偶联蛋白，结合后可抑制腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase，AC)的活性，从而减少cAMP 的量［8］。相反，EP2 和EP4 均为GS-偶联受体，通过偶联G 蛋白、激活AC 以上调cAMP水平，从而诱导AC 依赖的cAMP/PKA/CREB 通路传递信号［10］。此外，EP4 在磷脂酰肌醇(-3)激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)依赖的途径中还可激活细胞外信号调节激酶1/2(Extracellularsignal-regulated kinase1/2，ERK1/2)信号通路［11］。在机体免疫中，EP2 与EP4 是介导PGE2 抗炎和免疫抑制功能的主要受体［10］(图1)。

1.3 肿瘤发生发展中PGE2 对凋亡的调控 PGE2在细胞凋亡中的调控作用在肿瘤研究中有较多报道。不同生理与病理状态下，PGE2 通过作用于不同凋亡途径的调节与效应分子，对细胞凋亡可发挥促进与抑制两种相反的效应，从而对肿瘤的发生发展具有截然不同的影响。例如，在人的原代大肠癌细胞以及大肠癌细胞系HT-29、HCA-7 中，PGE2 与EP1 结合后将诱导Fas 配体(Fas ligand，FasL/CD95L)表达上调，后者通过结合肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)表面的Fas 受体而诱导TIL 发生凋亡，由此促进肿瘤细胞的生长［12，13］。阻断小鼠体内EP1 受体将下调FasL 的表达水平，从而抑制了FasL 诱导的免疫细胞凋亡，进一步地阻遏了肿瘤的免疫抑制作用，使活化的CD8+T 细胞可高效执行杀伤肿瘤细胞的任务。

相反，在肠癌研究中发现，PGE2 可上调原癌基因Bcl-2 以抑制细胞凋亡，但不影响原癌基因Bcl-xl与抑癌基因Bax 的表达［14］。此外，在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)中，PGE2 能迅速上调c-myc 基因的表达水平;c-myc 进而诱导致瘤性miR-17-92 表达，后者靶向下调抑癌基因——第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(Phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten gene，PTEN)，从而抑制细胞凋亡，促进癌变恶化［15］。

2 MTB 感染后巨噬细胞的凋亡

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染所引起、被列为重大传染性疾病的人类呼吸道传染病。全球约有三分之一的人口感染MTB。

图1 PGE2 的生物合成途径以及其受体效应示意图Fig.1 A diagram of PGE2 synthesis pathway and reaction with its receptors

MTB 感染机体后主要寄生在巨噬细胞中。而巨噬细胞作为天然免疫的重要组成部分，在抗MTB感染免疫中扮演重要的角色。与布氏杆菌、沙门氏菌等其他胞内寄生菌相似，感染机体后，分枝杆菌将经由模式识别受体被吞噬细胞识别与吞噬。溶酶体与包裹细菌的吞噬小体融合后，释放酸性水解酶杀伤病原菌。同时，吞噬细胞加工递呈病原菌抗原，从而激活T 细胞免疫反应。这样的免疫机制可以清除大部分的入侵病原菌。然而，MTB 强毒株的感染有可能改变机体的上述免疫机制［16］，其途径之一即为调控巨噬细胞死亡的方式，进而抑制免疫反应并促进病原菌的体内扩散。

MTB 减毒株能诱导被感染巨噬细胞发生凋亡，这是机体阻抑细菌繁殖、同时促进T 细胞交叉激活的重要防御机制［17］。凋亡小体包裹着入侵的MTB，并被其他吞噬细胞吞噬，从而使MTB 不致被释放入体液而感染更多的细胞。与此相反，诱导被感染巨噬细胞坏死是MTB 强毒株的一种非常有效的免疫逃逸策略。被感染细胞的坏死中断了免疫反应，并使MTB 可扩散至胞外，在体内散播。研究证实，这是MTB 强毒株通过损坏质膜，并阻碍溶酶体、内质网以及高尔基体的膜修复功能，致使细胞膜持续性损坏来实现的［18］。

被感染细胞吞噬体内尚存活的MTB 可分泌脂磷酸酶——SapM，不断水解吞噬体膜上的磷脂酰肌醇-3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P)。PI3P 是重要的膜运输脂类调节配体，可促进包裹MTB 的吞噬溶酶体形成，同时对于细胞质膜修复过程中囊泡的运输有着重要作用。PI3P 的降解一方面使MTB 得以阻止吞噬体与溶酶体融合形成吞噬溶酶体，从而逃避宿主的杀伤［19］;另一方面，使吞噬体与溶酶体融合后进行的细胞质膜修复过程也受到严重抑制［20］。此外，MTB 强毒株还会引起线粒体膜的损坏，进一步促进宿主细胞坏死［21］。胞膜与线粒体膜的完整性直接决定了细胞的死亡方式。

3 PGE2 对MTB 感染细胞凋亡的影响

在MTB 感染后的巨噬细胞凋亡或坏死的命运决定中，PGE2 发挥了关键的调节作用。磷脂酶(Phospholipases C，PLC)是在许多胞内寄生菌中能被编码表达的一个致病毒力因子，有研究表明，在表达PLC 的MTB 感染细胞中，细胞坏死率明显提高，而在外源性加入PGE2 后，此情况有显著的逆转。这些结果提示，PGE2 对阻碍MTB 诱导的细胞坏死有重要的作用［22］。

PGE2 对MTB 所诱导的巨噬细胞死亡方式的调控主要依赖于PGE2 在质膜修复以及保护线粒体内膜稳定性方面的重要作用。目前人们对该过程的具体调控机制认识较少，还有待深入研究。目前已知PGE2 至少通过两种相互独立的途径来阻止MTB 感染导致的巨噬细胞坏死:(1)PGE2 与EP2 结合后可通过激活PKA 产生大量cAMP。质膜修复的过程主要就是在cAMP 的参与下，依赖于内膜系统如内质网、高尔基体、溶酶体等的胞外分泌所形成的膜小泡通过囊泡运输至修复部位来进行的［23］。cAMP 通过参与修复受损质膜，从而保护细胞膜与线粒体膜免受MTB 感染所致的损坏。(2)PGE2 通过与EP4 结合可激活PI3K 通路，以此促进溶酶体分泌小泡的膜转位。在MTB 减毒株引起细胞凋亡的过程中，正是通过激活PI3K 信号通路来促进溶酶体的膜转位以修复质膜的。吞噬体内的MTB 减毒株能诱导PGE2依赖的溶酶体相关膜蛋白-1(Lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP-1)，经PI3K 信号通路进行囊泡运输至巨噬细胞膜上，即，通过溶酶体途径对质膜进行修复［20，24］。同时，PGE2 与EP4 的结合还可上调PI3K 的表达，PI3K 信号通路中将会产生大量的PI3P，进而拮抗MTB 感染所致的PI3P 水平下调效应，从而促进质膜修复［24，25］。

在质膜修复过程中，溶酶体与高尔基体的膜修复效应通路是相互独立的［24］。PGE2 对高尔基体囊泡运输途径的质膜修复过程并无明显促进作用，而主要通过促进溶酶体的分泌小泡膜转位来修复质膜。突触结合蛋白(Synaptotagmin 7，Syt-7)是溶酶体的钙感受器，溶酶体的胞外分泌及质膜修复过程均依赖于Syt-7 传递的钙诱导信号。因此在溶酶体质膜修复途径中，Syt-7 发挥着不可或缺的作用［26，27］，而其表达也受到PGE2 的调控。有研究表明在MTB 强毒株感染的细胞中，外源性PGE2 可使Syt-7 的表达水平上调近10 倍，从而增加溶酶体介导的胞外分泌，显著促进受损质膜的修复［24］。

研究证实，在缺乏PGE2 的微环境中，巨噬细胞不能修复由MTB 感染所引起的线粒体损伤，最终发生坏死。与PGE2 作用相反的是脂氧素A4(Lipoxin A4，LXA4)，它可通过下调COX-2 的mRNA 水平来抑制PGE2 的生物合成。在生理状态下，PGE2 与LXA4 的表达处于相对平衡。而MTB 强毒株能诱导LXA4 表达水平上升，通过抑制PGE2 的表达而抑制巨噬细胞的凋亡，同时促进被感染细胞的坏死［28，29］。花生四烯酸-5-脂加氧酶(Arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX-5)是催化AA 代谢为LXA4 的重要酶类。Alox5-/-小鼠感染强致病性MTB 后，巨噬细胞具有较强的激活CD8+T 细胞交叉应答的作用［30］。与此相一致的是，PGES-/-小鼠巨噬细胞不能控制H37Rv 菌株的繁殖，当机体感染强致病性MTB 后，其肺部荷菌量明显升高。

同时，有研究表明，在表达PLC 的MTB 感染细胞中，细胞坏死率明显提高，而在外源性加入PGE2后，此情况有显著的逆转。上述研究充分证实PGE2在MTB 感染早期对MTB 繁殖乃至对结核病的控制，具有必不可少的作用［30］。

4 总结

目前，细胞的凋亡途径研究较多，但PGE2 与凋亡的关联仍存在诸多未知。前期研究多集中于肿瘤领域，PGE2 通过调节细胞凋亡相关分子的表达水平与活性，从而对肿瘤的发生与发展有密切联系，这些都已有明确的研究报道。

然而，PGE2 在病原菌感染过程中对凋亡的调控研究较少。许多胞内寄生菌均可抑制宿主细胞的凋亡，借以作为生长繁衍的场所。其中最典型的代表即是MTB。被MTB 感染的巨噬细胞可通过凋亡而将入侵的病原菌包裹于凋亡小泡中，从而使病原菌被邻近吞噬细胞所吞噬，在实现交叉提呈的同时抑制MTB 的繁殖。但MTB 强毒株则会抑制巨噬细胞的凋亡，促使其坏死。随着胞膜的破裂，胞内的MTB 将释放至胞外，再寻找下一个宿主细胞以感染、繁殖。近年来开始有研究将PGE2 与结核感染的机制联系在一起，发现在被感染细胞的死亡命运的决定中，PGE2 发挥重要的调控作用，其机制与肿瘤发生发展过程有相似之处，但更多的是在感染中存在的、以质膜修复机制为代表的独特效应。若对PGE2 在MTB 感染细胞后的质膜修复及相关信号通路活化过程中的作用进行深入研究，将有助于更好地了解结核病的发生发展过程及病原菌与宿主的相互作用。对上述认识的合理利用，将为结核病的治疗提供新的途径。

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