丙泊酚对LPS诱导的大鼠急性肺损伤状态下SP-B表达的调节作用*

王慧娟　冯社军　李军涛　武艳强

(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)



丙泊酚对LPS诱导的大鼠急性肺损伤状态下SP-B表达的调节作用*

王慧娟冯社军李军涛武艳强

(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

【摘要】目的探讨丙泊酚对LPS诱导的大鼠急性肺损伤的保护作用和对肺组织肺表面活性蛋白B(SP-B)的调节作用。方法30只雄性Wistar大鼠(SPF级)随机分为对照组(Control组)、治疗组(LPS+Propofol组)和模型组(LPS组)每组10只。通过颈静脉注射LPS建立大鼠急性肺损伤(ALI)模型。采用HE染色观察肺组织病理学改变并进行肺损伤评分；采用湿/干比(W/D)值分析肺水肿严重程度；使用RT-PCR和western blotting对肺组织中SP-B的表达进行检测。结果在给予颈静脉注射LPS后，大鼠肺组织出现明显的病理改变和较高的肺损伤评分，W/D值明显升高，同时肺组织中SP-B mRNA和蛋白水平明显降低，差异均有显著统计学意义(P<0.05)。但与LPS组相比较，LPS+Propofol组大鼠肺组织病理变化较轻，肺损伤评分和W/D值较低，同时肺组织中SP-B mRNA和蛋白的表达水平较高，差异均有显著统计学意义(P<0.05)。结论镇静药丙泊酚可以有效改善大鼠ALI导致的肺部炎症反应和肺水肿，同时上调肺组织中SP-B的表达水平。但仍需进一步研究揭示丙泊酚对于ALI状态下SP-B的调节作用的分子机制和相关的信号通路。

【关键词】丙泊酚； 急性肺损伤； 急性呼吸窘迫综合征； 肺表面活性蛋白B

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一个疾病的连续两个不同阶段，其实质是各种严重的急性肺内和肺外病因包括重症肺炎、严重脓毒血症和重症胰腺炎等导致的肺部的自我放大的和失控的炎症反应[1~4]。肺表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)是维持肺顺应性和肺内液体平衡的重要物质，研究发现在ALI/ARDS状态下PS的表达明显降低，且与ALI/ARDS的严重程度密切相关[5, 6]。目前多个研究发现丙泊酚(propofol)具有抑制炎症反应和氧化应激的作用，同时还有研究证实丙泊酚对炎症状态下的肺上皮细胞具有保护作用[7~10]。本实验的目的是探讨在ALI状态下丙泊酚对肺组织的保护作用和对肺表面活性蛋白B (surfactant protein B, SP-B)的调节作用。

1材料和方法

1.1主要材料30只雄性Wistar大鼠(SPF级，6~8周，体重约180~220g)购于四川大学实验动物中心，分笼饲养，自由饮水与摄食。电泳单元及电泳附件、电源、湿转式电转仪和凝胶成像系统由Bio-rad公司提供。大肠埃稀杆菌内毒素(LPS)购自美国Sigma公司。聚合酶链反应(PCR)引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。总RNA抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，第一链cDNA合成试剂盒和PCR试剂盒购自美国Mbi Fermentas公司，SP-B和β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2方法

1.2.1动物模型建立30只健康雄性Wistar大鼠随机平均分为对照组(Control组)、治疗组(LPS+propofol组)和模型组(LPS组)，每组10只。腹腔注射戊巴比妥(40mg/Kg)麻醉大鼠。治疗组和模型组大鼠通过颈静脉注射LPS (5mg/Kg)诱导建立ALI模型。对照组给予生理盐水代替LPS。在LPS干预前30min和干预后30min，分别对治疗组大鼠以6mg/kg/min持续泵入丙泊酚(乐维静，四川国瑞药业有限责任公司) 5min，共2次[8]。LPS干预6h后处死大鼠，获取肺组织备用。

1.2.2HE染色观察病理变化并进行肺损伤评分取右下肺组织，常规制成5μm的石蜡切片，HE染色观察肺损伤程度，并进行肺损伤评分[7]。评分标准如下：①肺泡充血。②出血。③肺泡腔或血管腔中性粒细胞浸润或聚集。④肺泡壁增厚和(或)透明膜形成四项指标，分别依病变轻重评0~4分(0：无病变或非常轻微；1：轻度病变；2：中度病变；3：重度病变；4：极重度病变)。各项评定分数相加为ALI总评分[4]。血液离心后吸取血浆，放入-80℃冰箱中保存备用。

1.2.3肺组织湿/干比(wet to dry ratio, W/D)测定大鼠处死后取出肺部组织。将样本置于80℃烤箱24h至恒重后，记录前后肺组织重量，计算W/D值。

1.2.4RT-PCR法检测SP-B mRNA表达取左下叶肺组织，按照试剂盒说明书提取总RNA。以2μg总RNA为模板，用Oligo (dT)18作为引物，按照试剂盒说明书介绍要求合成cDNA第1链。SP-B正义5′-GAGGATATTGTCCACCTCCT -3′，反义5′-ATAGCCTGTTCACTGGTGT -3′；β-actin引物：正义：5′-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，反义：5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3′，PCR反应体系如下：2μl逆转录产物模板、PCR Master Mix (2×) 25μl、正反引物各2μl，以超纯水补充至50μl。应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。用SP-B/β-actin PCR产物条带灰度比值作为SP-B mRNA的相对表达量。

1.2.5Western blot法检测肺组织蛋白表达首先提取肺组织总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1h，分别加入兔抗鼠单克隆抗体磷酸化SP-B (1∶ 800)和β-actin (1∶ 5000)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

2结果

2.1肺组织病理变化肺组织切片进行HE染色后光镜下观察。对照组(Control组)：肺组织未见炎性细胞浸润，肺泡间隔均匀无增宽，肺泡结构清晰，无红细胞和透明膜形成，为正常肺组织。模型组(LPS组)：肺组织存在大量炎症细胞浸润，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔中大量水肿液，并可见较多红细胞进入肺泡腔，肺泡腔中可见透明膜形成。治疗组(LPS+Propofol组)：肺组织中存在炎症细胞浸润但较模型组明显减少，肺泡间隔轻度增宽，肺泡中少量红细胞和水肿液聚集，可见肺间质肺水肿。模型组大鼠肺组织损伤评分明显高于治疗组(P<0.05)，见图1、表1。

表1　三组大鼠肺组织损伤评分和W/D值±s)

注：与Control组比较①P<0.05，与LPS组比较②P<0.05

2.2肺组织SP-B表达水平采用RT-PCR和western blotting对肺组织中SP-B mRNA和蛋白水平进行检测。在经颈静脉注射LPS 6h后，大鼠肺组织中SP-B mRNA和蛋白水平均明显下降(P<0.05)。同时发现，LPS+Propofol组大鼠肺组织中SP-B表达水平较LPS组明显增加(P<0.05)，见图2、表2。

表2　三组大鼠肺组织SP-B mRNA和蛋白的表达水平

注：与Control组相比较，①P<0.05，与LPS组相比较②P<0.05

图1三组大鼠肺组织病理变化(HE染色，×200倍)

Figure 1The pathological changes in each group (HE staining, ×200)

图2三组大鼠肺组织SP-B表达RT-PCR和western blotting结果

Figure 2The RT-PCR and western blotting results of SP-B in rats

3讨论

急性肺损伤(ALI)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一个疾病连续的两个阶段。各种严重的急性肺内和肺外病因包括重症肺炎、严重脓毒血症和重症胰腺炎等导致的肺部的自我放大的和失控的炎症反应是导致ALI/ARDS发生的根本原因[1~4, 11]。目前研究发现严重的肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞损伤是导致ALI/ARDS直接原因[1~4, 11]。同时肺表面活性物质(PS)对维持肺泡的稳定性和肺组织顺应性、调节肺内液体平衡以及调节肺组织固有免疫和炎症反应均有重要的作用[5, 6]。PS的减少是ALI/ARDS重要的病理生理学改变之一。

PS作为一种大分子聚合物，化学成分非常复杂。PS主要由Ⅱ肺泡上皮细胞合成和分泌，包括磷脂和蛋白两部分，其他还包括糖脂和中性脂质。二棕榈酸磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)是PS中降低肺泡表面张力的最主要物质。表面活性物质相关蛋白(surfactant-associated protein, SP)包括4种，即SP-A、SP-B、SP-C和SP-D，其中SP-A和SP-D为亲水性蛋白；SP-B和SP-C为疏水性蛋白[5, 6, 12~14]。目前研究认为在ALI/ARDS状态下PS的减少与肺容积减少，肺泡塌陷，肺组织顺应性下降，高通透性肺水肿和氧合功能障碍等密切相关[12~14]。基础实验和临床研究发现若能够上调PS成分的表达或外源性给予PS可有效的改善ARDS的病理变化、临床症状以及患者预后[12~14]。

SP-B是PS重要的蛋白成分。SP-B基因首先经转录和翻译成约为42 kDa的单体前蛋白原，再经过修饰后形成成熟的SP-B同二聚体。SP-B可促进肺泡表面磷脂的吸附，具有维持肺泡完整性和气-液表面单分子层的稳定性降低肺泡表面张力的作用。管状髓磷脂由PS成分有机结合构成，是PS功能的基础，SP-B是管状髓磷脂形成的必需成分。同时研究证实SP-B还具有抑制肺部炎症反应的作用[14, 15]。研究发现上调PS组SP-A、SP-B和DPPC等的表达，对ALI/ARDS有保护作用[14, 15]。目前多个研究发现在多种病理状态下，丙泊酚(propofol)具有抑制炎症反应和氧化应激的作用[7~10]。同时还有研究证实丙泊酚对炎症状态下的肺上皮细胞具有保护作用[8]。

我们研究发现在给予大鼠颈静脉注射LPS 6h后，大鼠肺组织出现显著的病理学改变包括大量炎症细胞浸润，明显的肺泡间隔增宽，肺泡腔中大量水肿液，并可见较多红细胞进入肺泡腔，肺泡腔中可见透明膜形成等(见图1)。但给予丙泊酚干预的大鼠病理改变明显较模型组减轻。且进行肺损伤评分证实LPS+Propofol组大鼠评分较LPS组大鼠明显降低(表1)。肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞损伤导致的高通透性肺水肿是ARDS特征性改变之一。严重的肺水肿可直接导致有效肺容积降低，肺泡顺应性下降和氧合功能障碍，是导致ARDS患者早期死亡的重要原因[2]。本试验中我们使用肺湿/干比(wet to dry ratio, W/D)对各组肺组织水肿程度进行分析，发现LPS干预后大鼠肺组织W/D显著增加，但LPS+Propofol组大鼠W/D较LPS组较低，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明丙泊酚可以有效的抑制LPS诱导的大鼠ALI肺部炎症反应和肺水肿，对大鼠肺组织有保护作用。

进一步采用RT-PCR和western blotting法对SP-B mRNA和蛋白表达进行分析后发现LPS干预后大鼠肺组织SP-B表达水平显著降低(P<0.05)。同时发现，与LPS组相比较LPS+Propofol组大鼠肺组织中SP-B表达明显增加(P<0.05) (图2、表2)。该结果表明丙泊酚可有效上调大鼠ALI状态下肺组织SP-B的表达水平。

4结论

本实验研究表明丙泊酚能有效减轻LPS诱导大鼠ALI导致的肺部炎症反应和高通透性肺水肿，并可能与上调SP-B的表达密切相关。但仍需进一步的研究揭示丙泊酚调节SP-B的分子机制和相关的信号通路。

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Propofol enhances surfactant protein B in LPS-induced acute lung injury in rats

WANG Hui-juan，FENG She-jun，LI Jun-tao,etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of propofol on the expression of surfactant protein B (SP-B) in LPS-induced acute lung injury (ALI) in rats. Methods30 male Wistar rats were randomly divided into Control group, LPS+Propofol group and LPS group. HE staining and lug injury scores system were performed to analyze the pathological changes in lung. Wet to dry ratio (W/D) was used to detect the degree of lung edema. RT-PCR and western blotting were used to measure the expression of SP-B in lung. ResultsAfter 6h LPS injection, severe pathological changes, raised W/D, and reduction of SP-B in lung were observed. Nevertheless, compared with LPS group, pathological changes, lung injury scores and W/D were significantly attenuated. Meanwhile, SP-B expression was markedly promoted by propofol treatment. ConclusionOur data show that propofol enhanced the expression of SP-B in a rat model of LPS induced ALI.

【Key words】Propofol; Acute lung injury; acute respiratory distress syndrome; Surfactant protein B

(收稿日期：2014-04-14； 编辑： 陈舟贵)

通讯作者：李军涛,E-mail：lijuntao2014@163.com

基金项目：河北省卫生厅重点科研计划(20130359)

【中图分类号】R 563.8

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.01.003