黑龙江口岸地区鼠类动物中汉坦病毒感染情况调查

程 成，鞠文东，付维明，曹苏娅，徐 宁，王艳梅，耿 聪，王玉龙

黑龙江口岸地区鼠类动物中汉坦病毒感染情况调查

程 成1，鞠文东1，付维明1，曹苏娅2，徐 宁1，王艳梅1，耿 聪1，王玉龙2

目的 了解黑龙江省中俄边境11个口岸鼠类宿主动物携带汉坦病毒(Hantavirus,HV)状况及其分子流行病学特征。方法 采用夹夜法和鼠笼法捕获鼠类，应用巢式PCR方法对鼠肺样本进行检测，对阳性样本测序并分型，获得序列用MEGA6进行分析。结果 此次调查共捕获鼠类动物346只，经鉴定隶属3科9属11种。检测出汉坦病毒核酸阳性样本17份，平均带毒率为4.90 %，包括汉滩型病毒(Hantaan virus, HNTV)6例，汉城型病毒(Seoul virus, SEOV) 11例，首次在黑龙江口岸东方田鼠中检测到1例SEO型HV。进化分析表明，6株HNT型HV均与HNT型HV原型株76-118亲缘性较远(86.82%～88.43%)，分别与HNT型HV株BAO14、HXZ244同源性最高；11株SEO型HV分别与SEO型HV株Gongzhuling97、北京株BjHD01、越南株HaiPhong3-11同源性最高。结论 黑龙江中俄边境口岸宿主动物感染汉坦病毒至少2个类型，相对较高的感染率提示着中俄边境地区开展肾综合征出血热监测和防控的迫切性。

汉坦病毒；鼠类动物；巢式PCR；基因测序及分型；系统进化分析；分子流行病学

Supported by the General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China (AQSIQ) scientific research subject (Grant no. 2014IK047), the Heilongjiang Import and Export Inspection and Quarantine Bureau Autonomous Scientific Research Subject (Grant no. 2013HK006), and the Special Fund of the Central Universities Fundamental Research (Grant no. DL13CA04) Corresponding author: Wang Yu-long, Email: wangyl@nefu.edu.com

汉坦病毒(Hantavirus, HV) 属布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(hantavirus)，在临床上可引起肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和汉坦病毒肺呼吸综合征(Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)，主要由鼠类等啮齿类动物传播的一种动物疫源性病原体[1]。HFRS虽为世界性分布，但中国却是受HV危害最为严重的国家，每年都会超过10万个HFRS病例[2]，是世界上HFRS发病人数最多的国家。

HV 种类繁多，世界上至少有23个已经确定的种类和30多个暂定种类[3]，中国除汉滩病毒(Hantaan virus，HNTV)和汉城病毒(Seoul virus，SEO)以外，在宿主动物中还发现了普马拉病毒(Puumala virus，PUUV)、图拉病毒(Tula virus，TULV)和Amur病毒等病毒型[4-7]。王彩桥等人还在黑瞎子岛媒介监测中捕获的啮齿动物里，发现了哈巴罗夫斯基病毒(Khabarovsk virus，KBRV)和kenkeme病毒(KKMV)[8]，目前，在中国已有11种HV被识别[3]。黑龙江省是中国HFRS的老疫区和重疫区，主要以HTN型和SEO型为流行型，其中以HTN型为主[7，9]。近几年尽管黑龙江省疫情呈下降趋势，但发病率仍然名列全国前列[9]。自上世纪30年代初，中国首次在黑龙江下游、中俄边境地区发现HFRS，尤其是近年，已证实俄罗斯远东地区的HV 自然疫源地中循环的HV 血清型和基因型存在明显的多样性[10]，因此黑龙江中俄边境口岸作为重点监测的地区之一，倍受检验检疫部门的重视，鉴于此，为了加强中俄边境地区宿主动物中HV感染情况的监测，本研究在黑龙江省中俄边境11个口岸采集鼠类宿主动物，开展HV分子流行病学调查研究，为进一步研究中俄边境口岸HV流行病学情况及预防控制措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 鼠标本的采集 2014年3-8月间，在黑龙江省中俄边境同江、哈尔滨机场、密山、绥芬河、佳木斯、嘉荫、东宁、富锦、虎林、萝北、牡丹江11个口岸以夹夜法(晚放晨收)和鼠笼法捕获鼠类。将现场捕获的鼠类依据其外部形态特征进行鉴定、分类，并登记编号，记录捕捉日期、生境及其生物学特征，装入已编号鼠袋带回，备用。

1.2 实验室处理

1.2.1 鼠肺样本的采集及研磨 采集鼠肺标本于2 mL无菌离心管中，编号标记后，置于冰上，向离心管内加入无菌不锈钢珠和400 μL 无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，用组织研磨器研磨0.5～1 min(时间不宜过长)，使组织匀浆。将匀浆液4 ℃，8 000 g离心1 min，将上清分装至1.5 mL离心管中用于核酸提取。

1.3 实验方法

1.3.1 引物 根据汉坦病毒M片段设计两套巢式PCR引物，内套引物分别对汉滩(HTN)型和汉城(SEO)型病毒具有特异性(表1)，可分别获得383 bp、418 bp大小的片段。引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

表1 研究中所用引物

1.3.2 RNA提取及cDNA合成 从鼠肺研磨液中提取总RNA，使用Trizol RNA提取试剂(Invitrogen)按操作说明立即提取总RNA。以病毒RNA为模板，利用PrimeScript RT Reagent kit(TaKaRa) 进行逆转录合成cDNA，方法参照反转录酶说明书。合成的cDNA 即可用于PCR 反应。

1.3.3 PCR PCR反应采用套式PCR，即先用HTmlF和HTmlR引物扩增，然后再用HTN型特异性引物HTm2F/HTm2R和SEO型特异性引物STm2F/ STm2R扩增。PCR条件均是95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 PCR 产物的序列测定 阳性PCR 产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司直接测序，获得序列与GenBank 中的序列进行序列比对。用Mega6软件中的Algnment进行汉坦病毒M基因片断的同源性(distance)和进化树分析(phylogeny)。本研究采用的参考毒株序列均取自GenBank。

2 结 果

2.1 宿主动物调查结果 本次调查共捕获鼠类动物346只，经鉴定隶属于3科9属11种，捕获的鼠类动物中黑线姬鼠(Apodemusagrarius)190只，占捕鼠总数的54.9%，为优势种群，其次为褐家鼠(Rattusnorvegicus)26.0%和大仓鼠(Cricetulustriton)3.4%(表2)。

2.2 HV检测结果 在346份鼠肺组织样本中共检出HV核酸阳性标本17份，总带毒率为4.9%。其中HNT型核酸阳性样本6份，带毒率为1.7%(6/346)，SEO型核酸阳性样本11份，带毒率为3.2%(11/346)。不同鼠种之间，东方田鼠、褐家鼠、黑线姬鼠的，带毒率分别为16.7%、12.2%和2.6%。但从类型分布分析，黑线姬鼠中HNT型与SEO型的比例为4∶1；而褐家鼠为2∶9，差异有统计学意义(χ2=18.95,P=0.0001)，这说明了黑线姬鼠为HNT型病毒的主要宿主，而褐家鼠为SEO型病毒的主要宿主，表明了汉坦病毒的不同类型对宿主具有一定的选择性[12]。(表2)。分析11个口岸带毒率情况，其中富锦带毒率最高为50%(2/4)，其次是东宁和佳木斯，带毒率分别是14.3%(1/7)，13.3%(4/30)。其中富锦、东宁、佳木斯、哈尔滨机场以SEO型病毒为主要流行型，同江、虎林以HNT型病毒为主要流行型。

2.3 序列测定结果 通过序列测定，获得了17例汉坦病毒部分的M片段序列，经Blast比对后，确定6例HNT型HV，11例SEO型HV(表3)。

2.3.1 HNT型 结果显示，编号TJ2014-1、TJ2014-2、TJ2014-3、TJ2014-14序列相近，与HNT型HV株BAO14同源性最高(96.80 %～97.12 %)；编号HL2014-11、MDJ2014-6序列相近，与HNT型HV株HXZ244和HXZ245同源性最高(95.47%～95.78%)；该6株HNT型HV均与HNT型HV原型株76-118亲缘性较远，同源性在86.82 %至88.43 %之间。TJ2014-1、TJ2014-2、TJ2014-3、TJ2014-14与HNT型HV株BAO14、Jiang13、AA2499共同位于一个大支系(图1中分支1# )，HL2014-11、MDJ2014-6与HNT型HV株HXZ244和HXZ245位于一个支系(图1中分支2#)。

2.3.2 SEO型 结果显示，编号JC2014-12、JC2014-20、MDJ2014-24、JMS2014-16、JMS2014-19、JMS2014-21、JMS2014-30、TJ2014-11序列相近，其中TJ2014-11与SEO型HV株Gongzhuling97同源性最高(98.86 %)，其余与北京株BjHD01同源性最高(98.86 %～99.25 %)，并且共同位于一个支系(图2中分支1#)；FJ2014-1、FJ2014-2序列相近，与SEO型HV株JiyuanRn60同源性最高分别是99.15 %、98.86 %，并且与HuaxianRn223等SEO型HV株共同位于一个支系(图2中分支2#)；DN2014-2与越南株HaiPhong3-11、HaiPhong24-11、HaiPhong31-11同源性最高(97.77%～98.28%)，并且共同位于一个支系(图2中分支3# )。

表2 不同鼠种HV检测结果

3 讨 论

本次调查共捕获鼠类动物346只，隶属于3科9属11种，其中中黑线姬鼠和褐家鼠为优势种群，但是在HV带毒率却发现褐家鼠为12.2 %(11/90)，黑线姬鼠仅为2.6 %(5/190)，两者带毒比例相

Bao14 (AB127995.1), Jiang13(AB027067), AA2499(AF427327), HXZ244(KF477195.1), HXZ245(KF477196.1), 76-118(Y00386.1).

图1 基于M片段部分核苷酸序列所构建的HNT型系统发生树

Fig.1 Phylogenetic trees of HNTV based on partial M segments

差明显(4.7∶1)；不仅如此，还在同江及牡丹江口岸的褐家鼠中检测到两例HNT型HV；在哈尔滨机场和牡丹江口岸的黑线姬鼠及东方田鼠中检测到两例SEO型HV，这提示HV的定型不能仅仅依赖以往的流行病学，临床特征经验[11]。

值得注意的是，我们在牡丹江口岸的东方田鼠样本中检测到1例SEO型HV。目前为止，由于汉坦病毒的宿主选择性[12]，在黑龙江省宿主动物中仅从黑线姬鼠、褐家鼠中检测到HV[7，13]。尽管陈露菲等人近期曾在黑龙江大林姬鼠中检测到Amur型HV[7]，但有关黑龙江东方田鼠中SEO型HV的报道尚属首次，提示了汉坦病毒经过不断进化，有可能突破了宿主屏障，引起了HV在其他动物物种之间的流行和传播[14]。

Gongzhuling97 (KF745936.1), BjHD01 (DQ133505.1), Gongzhuling42 (KF745932.1), Gongzhuling108 (KF745937.1), Gongzhuling415 (KF745939.1), HLD65 (EF205377.1), HLD78 (EF205378.1), RuianRn180 (GU592931.1), HuaxianRn223 (FJ884509.1), HuaxianRn202 (FJ884508.1), JiyuanRn60 (FJ884515.1), HuaxianRn40 (GU592924.1), XiaotangshanRn7 (GU592929.1), HaiPhong3-11 (AB674759.1), HaiPhong24-11(AB674761.1), HaiPhong31-11(AB674762.1).

图2 基于M片段部分核苷酸序列所构建的SEO型系统发生树

Fig.2 Phylogenetic trees of SEOV based on partial M segments

表3 序列编号列表

从各个口岸的HV带毒率分析，富锦带毒率最高，东宁和佳木斯次之、同江、虎林、牡丹江、哈尔滨机场较低，其余口岸未检出，这可能与采样数量和生境选择有关，例如富锦采集数量仅为4只，采集样本为生活区的褐家鼠，这可能是其带毒率较高的原因。但是从总体带毒率角度分析，此次调查共检出HV核酸阳性率为4.9 %，与之姚昆[10]等人在2005-2006年调查鼠携带HV 总阳性率为6.25%，侯咏[15]等人在2010年调查鼠携带HV总阳性率为7.46%相比，均有明显下降，这说明了近几年黑龙江检验检疫部门在加强黑龙江中俄口岸HV疫情的监测和防控等方面取得了一定的成绩。

本研究利用巢式PCR，通过特异性HV分型引物对17例HV直接分型，并通过测序比对进一步确定其型别，保证了检测结果的准确性和可靠性。6株HNT型HV均与HNT型HV原型株76-118亲缘性较远，同源性在86.82%至88.43%之间，说明产生了很大的变异；11例SEO型HV，其与北京株BjHD01同源性达99.15%，并且共同位于一个支系(图2中分支1#)，说明了HNT型和SEO型变化的速度可能不完全一致；值得关注的是分离自东宁的DN2014-2，其与越南株HaiPhong3-11、HaiPhong24-11、HaiPhong31-11共处于一个支系(图2中分支3# )，且同源性最高可达98.28 %，表明，该株HV可能为SEO型的不同亚型。同江、佳木斯和富锦分离的HV有较大的同源性，在地理位置上这3个地区毗邻，说明了HV的空间分布具有一定的地理簇集性[13]。

黑龙江省肾综合征出血热疫情在90年代末时处于高峰期[16-17]，仅1995年发病率为28.41/10万，在疾病预防控制部门和检验检疫部门的共同努力下，近年来黑龙江省肾综合征出血热疫情呈下降趋势，据2013年统计，黑龙江省2008-2013年出血热发病率平均值为4.37/10万[18]，但相对其他省份而言，形势依然严峻，发病率仍然较高，又因与HV自然疫源地的俄罗斯毗邻，因此，黑龙江中俄口岸肾综合征出血热的危害一直受到广泛关注。分子流行病学的快速发展也给肾综合征出血热的监测和检测提供了新的技术和方法，因此，进一步加强黑龙江中俄边境口岸地区宿主动物感染汉坦病毒分子流行病学调查的研究，及时掌握肾综合征出血热的感染强度和疫源地活跃度，将为该病的长期监测和防控，提供必要的理论基础和决策依据。

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Epidemiologic investigation on Hantavirus carried by rodents at Heilongjiang frontier ports

CHENG Cheng1,JU Wen-dong1,FU Wei-ming1,CAO Su-ya2,XU Ning1,WANG Yan-mei1,GENG Cong1,WANG Yu-long2

(HeilongjiangInternationalTravelHealthcareCenter,Harbin150001,China)

We investigated the rodent carrying the Hantaan virus (HV) and the characteristics of molecular epidemiology at Heilongjiang frontier ports at Sino-Russia border. The night trapping and mouse cages were used to capture rodents, rodent lung samples were detected by nested PCR method, positive samples were sequenced and genotyped, and obtained sequences were then analyzed by MEGA6. In this survey, we captured 346 rodents, identified to be 3 families, 9 genera and 11 species. A total of 17 samples carried Hantavirus were with the infection rate of 4.9%. In which, 6 samples belonged to HNTV and 11 samples to SEOV, which was the first case of SEOV detected fromMicrotusfortisin Heilongjiang Port, China. Phylogenetic analysis showed that 6 strains of Hantavirus were not closely related to the prototype strain Hantaan76-118 (homology was 86.82%-88.43%), but showed high homology with HNT BAO14 and HNT HXZ244 strains. The 11 strains of Seoul virus showed high homology with SEO Gongzhuling97, SEO BjHD01, and SEO HaiPhong3-11 (isolated from Vietnam) strains respectively. Based on the above results, we can analyse that at least two types of Hantavirus infected by rodent at Heilongjiang Sino-Russian border, and a relatively high infection rate suggested the importance of increasing monitoring and control HFRS at Sino-Russian border areas.

Hantavirus; rodents; nested PCR; gene sequencing and genotyping; phylogenetic analysis; molecular epidemiology

国家质量监督检验检疫总局科研基金(2014IK047)；黑龙江出入境检验检疫局科研基金(2013HK006)；中央高校基本科研业务费专项资金(DL13CA04)

王玉龙， Email：wangyl@nefu.edu.com

1.黑龙江国际旅行卫生保健中心，哈尔滨 150001； 2.东北林业大学，哈尔滨 150040

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.019

R373. 9

B

1002-2694(2015)07-0681-06

2014-10-20；

2015-05-06