家兔自然感染戊型肝炎病毒的动态观察

李 军，张宏馨，廉海晨，周艳春，耿彦生

家兔自然感染戊型肝炎病毒的动态观察

李 军，张宏馨，廉海晨，周艳春，耿彦生

目的 了解自然条件下家兔感染戊型肝炎病毒(HEV)的方式和感染标志物的动态变化。方法 对养兔场28 d龄家兔断乳、分笼饲养，每周1次采集粪便检测HEV RNA，粪便HEV RNA转为阳性的家兔，每周采集静脉血，所有家兔每满1月龄时采集静脉血，进行血清HEV RNA、抗HEV-Ab及转氨酶检测，动态观察各种指标的变化直至家兔满5个月龄出栏。结果 共对47只家兔追踪观察，7周至5个月龄的10只家兔(21.3%，10/47)粪便中检测到HEV RNA，排毒时间在3～10周以上；其中7只家兔(14.9%，7/47)形成了病毒血症，病毒血症的出现晚于粪便排毒1～3周，持续时间为2～5周；至出栏时共有11只家兔(23.4%，11/47)转化为抗HEV-Ab阳性。基因序列分析显示HEV分离株均为兔HEV。结论 家兔从断乳到出栏的整个生长过程均对HEV均易感。家兔粪便排出病毒的时间比病毒血症持续时间长，但有家兔出栏时还处于病毒血症时期，因而家兔粪便及肉类制品可能具有传播兔HEV的危险性。

戊型肝炎病毒；家兔；兔HEV；自然感染

戊型肝炎病毒 ( Hepatitis E Virus, HEV ) 是戊型肝炎的病原体。大量证据表明自然界存在HEV的动物宿主，HEV能够由动物传播给人，戊型肝炎是一种人兽共患病[1]。目前已经从猪、野猪、鹿、家兔、老鼠、蝙蝠、骆驼以及禽类等动物中分离到了HEV或HEV类似病毒。来源于不同种属动物的HEV的基因序列差异很大，宿主范围不同。已确认能够感染人类的HEV有四种基因型，即1-4型：基因1和2型HEV只感染人，而3和4型HEV既感染人也感染猪等动物[1]。我国各地近年来戊型肝炎多为散发病例，分离到的病毒主要为4型和少量3型HEV，这些散发病例可能与动物HEV的传播有关[2-3]。

2009年首次在家兔中分离到HEV，称为兔HEV，其基因序列与HEV 1～4型中的基因3型最接近，全长基因组核苷酸序列相同性为78%～81%，被认为属于3型HEV 的一个变种[4-5]。由于兔HEV是新发现的病毒株，其传播方式、宿主范围及致病特点等都有待深入研究。本研究是对养殖场刚刚断乳、分笼饲养的家兔进行前瞻性研究，通过动态观察粪便和血液中HEV RNA及血清中特异性抗HEV抗体(HEV-Ab)等指标的变化，了解饲养过程中家兔感染HEV的情况及感染的发展过程。

1 材料与方法

1.1 实验设计 2013年4-10月在河北省的一个养殖场进行家兔HEV感染情况的定群前瞻性观察。由7只母兔生产的7窝共47只按照养兔场的常规方法进行饲养，4周龄时(28 d左右)家兔停止母乳喂养，分笼饲养。每周1次取家兔粪便样本进行HEV RNA检测，若出现阳性，则每周采集粪便的同时采集血液样本，其余家兔每当满1、2、3、4和5个月龄时采血，血液样本分离血清，进行HEV RNA、HEV-Ab及转氨酶检测。所有家兔连续观察至5个月出栏，出现HEV感染标志物的家兔至少观察10周。

1.2 抗HEV Ab的检测 应用北京万泰生物药业股份公司生产的“戊型肝炎病毒抗体(HEV-Ab)酶联免疫诊断试剂盒(双抗原夹心法)”，按照说明书进行检测。酶联免疫吸附试验(ELISA)S/CO = 测定的样品OD值/Cutoff值(临界值)，S/CO>1为阳性。

1.3 HEV RNA 的检测 应用北京全式金生物有限公司的“EasyPure Viral DNA/RNA Kit”，按照试剂盒说明书从200 μL血清或粪便样品中提取病毒RNA，用50 μL纯水对所提取的RNA进行回收。取10 μL RNA提取物，应用全式金TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，使用随机引物合成基因组cDNA(第一链)，反应条件为42 ℃，30 min。 取第一链进行cDNA套式PCR(Nested-PCR)扩增，外侧引物为：HEV-cs (5′-TCG CGC ATC ACM TTY TTC CARAA-3′) 和 HEV-cas (5′-GCC ATG TTC CAG ACD GTR TTC CA-3′); 内侧引物为: HEV-csn(5′-TGT GCT CTG TTT GGC CCN TGG TTY CDG-30)和HEV-casn (5′-CCA GGC TCA CCR GAR TGY TTC TTC CA- 3′)[6]，PCR反应条件与以前报道相同[7]。扩增片段282 bp，位于HEV基因组ORF1区域。

1.4 HEV的基因序列测定及序列分析：应用上述PCR内侧引物对纯化后的PCR产物进行双向序列测定，PCR产物纯化及测序由北京六合华大生物技术公司完成。应用 Clustal W2和Mega5.2 软件，将本研究分离到的HEV序列与GenBank中有代表性的HEV基因序列进行比对分析。

1.5 统计分析 应用SPSS17.0进行统计学分析，同一指标组间率的比较应用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同月龄家兔HEV的感染情况 家兔满1个月分笼，初次采集粪便和血液样本。粪便和血清中均未检测到HEV RNA。但16只(34%，16/47)家兔抗HEV-Ab为阳性，S/CO值在1.12-4.85之间。

1只家兔6周龄时首次在粪便中检测到HEV RNA，是排出病毒最早的家兔。在1～2、2～3、3～4和4～5个月龄时，分别有2、3、3和2只家兔粪便HEV RNA转化为阳性；在这几个时间段内血清HEV RNA转为阳性的家兔分为0、2、3和2只(表1)。除外0～1个月(哺乳期)，不同月龄家兔新发生感染率没有明显差异。

家兔满2月龄时进行血清HEV-Ab检测，只有1只为阳性，由此可以推测1月龄时血清中HEV-Ab来源于母体，到2月龄时已消失。到3、4和5个月龄时，分别有3、4和3只家兔的血清HEV-Ab由阴性转化为阳性(表1)。

表1 47只家兔在不同月龄时HEV感染发生的情况

2.2 家兔粪便和血清中HEV RNA的动态变化 在47只家兔中，有10只(21.3%，10/47)在粪便中检测到HEV RNA，其中7只(14.9%，7/47)转化为病毒血症。这7只家兔中，6只血清检测到HEV RNA的时间比粪便晚1～3周，只有1只血清和粪便中同时检测到HEV RNA。家兔病毒血症持续时间在1～5周，而粪便排毒时间比较长，2只家兔(R3-2和R4-1)粪便HEV RNA连续阳性超过10周，另外5只粪便排毒持续2～8周(表2)。

另有3只家兔(编号为R4-2、R4-4和R5-2)粪便连续检测到HEV RNA，但血清中未检测到HEV RNA(表2)。

表2 自然感染HEV家兔粪便排出病毒和病毒血症的情况

2.3 家兔血清中抗HEV-Ab的动态变化 感染HEV形成病毒血症的7只家兔，血清HEV-Ab的动态变化曲线基本相同：检测到HEV RNA的0-1周后血清HEV-Ab均转为阳性，2～4周后HEV-Ab浓度达到最高值，HEV-Ab在高水平持续数周。只有粪便排毒而未形成病毒血症的3只家兔中1只家兔(R4-2)在观察期内未检测到HEV-Ab，另2只血清出现了抗体(R4-4和R5-2)，但S/CO值较低(图1)。

有2只家兔(RA1和RA2)血清和粪便中均未检测到HEV RNA，但分别在2个和4个月龄时血清中出现HEV-Ab，但随时间延HEV-Ab的S/CO未见明显升高(图1)。

2.4 HEV病毒株基因序列分析 将PCR产物进行序列测定，获得ORF1区域282 bp的基因片段。经序列比对发现同一只家兔的血液和粪便样本中所获得的基因序列相同，来源于10只家兔的HEV有4个不同序列，代表4个病毒株(图2)。在基因遗传进化树中，这些新序列与GenBank中已知的兔HEV排列在一起，形成基因3型HEV中的一个分支(图2)。

3 讨 论

在我国，家兔一种重要的经济动物，饲养普遍，与人类接触密切。流行病学调查显示，不同地区、不同种系的家兔中均有HEV感染[8]。由于兔HEV基因序列与感染人的基因3型HEV最接近，具有潜在的感染人的可能性。为了解家兔通过自然途径感染HEV的发生及发展过程，本文选择HEV感染率较高的养兔场进行前瞻性定群研究，对普通环境下饲养的47只家兔从分栏到出栏的整个生长期进行跟踪观察。

The ELISA OD values are plotted over weeks after the presence of detectable HEV-Ab in rabbits RA1 and RA2 and the onset of faecal virus shedding in other rabbit.

图1 自然感染HEV的家兔血清抗HEV-Ab的动态变化

Fig.1 Seroconversion in rabbits naturally infected with HEV

The tree was constructed using the Neighbor-Joining method by Mega 5.2 software. The scale bar indicating the number of character state changes is proportional to the genetic distance. Hepatitis E virus isolates from this study are indicated by black triangle.

图2 新检测的兔HEV基因序列的遗传进化分析

Fig.2 Phylogenetic tree of hepatitis E virus isolates based on partial ORF1 sequences (282 nt)

研究发现，除1个月龄内(哺乳期)的家兔粪便中均未检测到HEV，在2、3、4 及5个月龄时，均有家兔粪便HEV RNA由阴性转为阳性，粪便中检测出HEV RNA的最小家兔为7周龄，而有2只家兔在4～5月龄时粪便中开始检测到病毒，表明从断乳到出栏的整个生长过程中家兔对HEV均易感。这个结果提示，出栏时的家兔仍可能处于病毒血症时期，从而使屠宰后的兔肉带有病毒。

到5月龄出栏时，47只家兔中共有12只检测到HEV RNA或HEV-Ab，表明25.5%(12/27)的家兔可能有HEV 感染，与前期对家兔感染的流行病学调查结果[4,7-8]一致。本研究通过连续观察，发现兔HEV感染有3种情况： 1)7只家兔感染后形成病毒血症； 2)3只家兔感染后，只有粪便排毒而没有形成病毒血症。其中3只家兔血清抗体转为阳性，另1只观察10周未见抗体产生； 3)2只家兔血清抗体阳性，血清和粪便中均未检测到HEV RNA。最近，有学者以兔HEV作为动物模型，通过静脉注射的方式使家兔感染HEV进行不同目的研究[5,9-10], 在这些研究中HEV感染通常表现为第一种形式，即出现病毒血症和粪便排毒。家兔自然感染HEV展现出了更为复杂多样的形式和过程。第二种情况的家兔值得注意，由于没有形成病毒血症(或未到检出水平)，血清HEV-Ab产生量低，可能会延缓对病毒的清除，使HEV能够以低水平在家兔体内长期储存。

在形成病毒血症的家兔中，感染标志物出现的顺序依次为粪便HEV RNA、血清HEV RNA和血清HEV-Ab。家兔粪便中HEV RNA出现较早，消失晚，粪便排毒时间明显比病毒血症时间长，有2只家兔排出病毒时间甚至超过10周。由于家兔粪便中含有病毒，当兔笼、吸水瓶等器具被粪便污染后，通过器具交换使用，使HEV能够在家兔-家兔之间进行传播。而饲养员在工作中经手接触家兔粪便也可能引起HEV从家兔-人的传播。家兔长时间持续排毒，增加了饲养过程中兔HEV从家兔-家兔，以及从家兔-人的传播的可能性。

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Dynamic observation of rabbits naturally infected with hepatitis E virus

LI Jun,ZHANG Hong-xin,LIAN Hai-chen,ZHOU Yan-chun,GENG Yan-sheng

(HebeiUniversity,Baoding071000,China)

To determine the pattern of hepatitis E virus (HEV) infection and the dynamic changes of the biological markers indicating the infection in naturally infected framed rabbits, a total of 47 weaned rabbits of age 4 weeks in a farm were studied. Feces of the rabbits were collected and HEV RNA detection was conducted weekly. Blood samples were collected monthly from the non-infected rabbits, while weekly from the rabbits with viral faecal virus shedding. HEV RNA and anti HEV-Ab were detected in all serum samples. The rabbits were monitored to slaughter at 5 months of age, and the rabbits with the presence of HEV infection markers were observed for at least 10 weeks. HEV RNA was firstly detected in feces at 7 weeks of age. Totally 10 rabbits (14.9%, 7/47) shed HEV in feces at 2-5 months of age, and 7 rabbits (21.3%, 10/47) developed viraemia. The durations of viraemia were 2-5 weeks, but in contrast the durations of faecal virus shedding were 3 to more than 10 weeks. Seroconversion occurred in 9 of the 10 rabbits with faecal virus shedding and in 2 rabbits with undetectable HEV in feces or serum. Sequence analysis of the PCR amplicons showed that all HEV isolates in this study clustered with known rabbit HEV strains. In conclusion, farmed rabbits are susceptible to HEV infection in the growth period from weaning to slaughter. The durations of virus excretion by faecal shedding are longer than viraemia. Therefore, the rabbit feces and the contaminated meat may have risks to transmit HEV.

hepatitis E virus; farmed rabbit; rabbit HEV; natural infection

Geng Yan-sheng, Email:ysgeng09@hotmail.com

河北省自然科学基金项目(No.12277726)

耿彦生，Email:ysgeng09@hotmail.com

河北大学医学部，保定 071000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.020

R373

A

1002-2694(2015)07-0687-04

2014-10-28；

2015-05-18

Supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province (No. 12277726 )