基因芯片技术检测贵州省结核分枝杆菌耐药基因KatG和inhA

欧维正，陈峥宏，陈 静，骆科文，王 燕，秦 万，蒙 俊

基因芯片技术检测贵州省结核分枝杆菌耐药基因KatG和inhA

欧维正1，陈峥宏2，陈 静1，骆科文1，王 燕1，秦 万1，蒙 俊1

目的 了解本地区结核分枝杆菌(MTB)异烟肼(INH)相关耐药基因katG和inhA的突变特征，评价基因芯片法对MTB INH耐药性检测的临床应用价值。方法 应用基因芯片法对经PCR-荧光探针法鉴定为MTB阳性的2 738例病人标本进行INH耐药性检测，分析其相关耐药基因katG和inhA的突变特征，同时应用比例法检测上述同期送检的相同病人的同类型标本经罗氏培养MTB阳性菌株的INH耐药性，比较两种方法的检测结果。结果 2 738例MTB核酸阳性标本经基因芯片法检测，INH耐药465例，耐药率16.98%，其中以katG315(AGC→ACC)突变为主，基因突变率为78.06%，其次为inhA-15(C→T)，katG315(AGC→AAC)，突变率分别为16.13%和5.59%。上述病人同期送检的同类型标本有1 493例经罗氏培养MTB阳性，比例法检测，INH耐药255例，耐药率17.08%，对应的基因芯片法检测结果为INH耐药249例，耐药率16.68%。以比例法结果为判断标准，基因芯片法测定INH耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及准确性分别为85.49%、97.50%、87.55%、97.03%和95.45%。结论 本地区INH耐药以katG315(AGC→ACC)和inhA-15(C→T)突变类型为主；基因芯片对MTB INH耐药性检测具有高敏感性、特异性、准确性和快速性，可用于本地区MTB INH耐药性的快速检测。

基因芯片；异烟肼；基因突变；比例法药物敏感性试验；结核分枝杆菌

异烟肼(isoniazid，INH)是治疗结核病的首选化学药物，对结核病的有效控制起着重要作用。但目前结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)对INH的耐药率已达17.6%[1]，是结核病治疗失败的一大原因。目前，对于INH耐药性检测的方法有多种，但大部分检测方法所需时间较长，传统方法是以培养为基础的绝对浓度法和比例法，需要2～3个月时间才能得到药物敏感性结果。放射性快速诊断技术(BACTEC)可将耐药性检测时间缩短到2～4周，但仍不能满足临床的需要。近年来，基因芯片等分子药敏检测技术进展迅速，其最大优点是快速，通常1 d即可获得药敏结果，但也存在只能检测主要耐药基因常见突变位点的问题，并且，耐药基因突变位点因国家和地区而有所差异[2-4]，其检测的敏感性、特异性、准确性和地区适用性有待临床验证。为此，本研究从我院近两年的17 452例临床送检标本中，经PCR-荧光探针法检测MTB核酸后，筛选出2 738例不同病人的MTB核酸阳性标本，应用基因芯片法检测MTB对INH的耐药性，分析本地区INH相关耐药基因katG和inhA的突变特征，同时与传统比例法结果比较，为本地区基因芯片法快速检测INH药物敏感性的推广应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 2012年4月至2014年5月来自我院门诊、住院病人送检标本共17 452例。病人来源分布于贵州省各地，年龄20 d至96岁，男：11 143人次，女：6 309人次。送检标本包括8 814例痰(含咽拭子)、4 064例支气管灌洗液、2 602例胸水、195例腹水、784例脑脊液、438例穿刺液、409例分泌物、123例尿液和23例其他标本。

1.1.2 MTB核酸提取和PCR-荧光探针法检测试剂 为博奥生物有限公司生产的“晶芯®分枝杆菌核酸检测(PCR-荧光探针法)试剂盒” [注册号为国食药监械(准)字2010第3400530号]。

1.1.3 MTB耐药基因芯片法检测试剂 为博奥生物有限公司生产的“晶芯®结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法)” [注册号为国食药监械(准)字2010第3400383号]，检测指标含INH耐药相关基因katG基因和inhA基因启动子各1个位点，分别为katG基因315位野生型及AGC→ACC和AGC→AAC两个突变型，inhA基因启动子-15位野生型及C→T突变型。

1.1.4 培养基 改良罗氏培养基、INH含药改良罗氏培养基为珠海市银科医学工程有限公司产品[注册号为粤食药监械(准)字2012第2400717号]。用于比例法检测的INH含药培养基药物终浓度为0.2 μg/mL。

1.1.5 主要仪器 ABI 7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)、K30干式恒温器(上海之信仪器有限公司)、TG16台式高速离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)、XW-80A型旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、TC06/G/H(b)基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)、生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)以及ExtractorTM36核酸快速提取仪、BioMixerTMII芯片杂交仪、SlideWasherTM8芯片洗干仪、LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪(以上均为博奥生物有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和PCR-荧光定量法检测MTB核酸 将17 452例标本严格按试剂说明书及标准操作规程(SOP)进行PCR荧光定量分析，以扩增呈S型曲线且CT值<36判断为阳性，以试剂盒自带的阴阳性对照作为质控。MTB核酸阳性标本提取的DNA置-20 ℃保存备用。

1.2.2 MTB INH耐药基因芯片法检测 筛选MTB核酸阳性标本(MTB核酸浓度较低，CT值>32者除外)按试剂说明书及SOP进行PCR扩增、芯片杂交、洗涤、甩干和结果扫描判读。以试剂盒自带的阴阳性对照作为质控。

1.2.3 MTB培养和比例法药物敏感性试验 上述标本中6 142例同期送检做MTB罗氏培养，对分离到的MTB菌株参照《结核病诊断实验室检验规程》[5]进行比例法药物敏感性试验，以MTB标准株H37Rv(ATCC27294)为质控菌株。

2 结 果

2.1 PCR-荧光定量检测结果 17 452例MTB核酸检测中，3 966例MTB核酸阳性，阳性率为22.73%(3 966/17 452)。

2.2 基因芯片法检测结果 3 966例MTB核酸阳性标本中，剔除825例MTB核酸浓度较低、CT值>32者，有3 141例为合格标本，占全部阳性数的79.20%(3 141/3 966)，除去同一病人重复检测次数后实为2 738例用于基因芯片检测。其中，INH耐药465例，耐药率16.98%。突变类型包括：katG315(AGC→ACC)单一突变358例，katG315(AGC→AAC)26例，inhA-15(C→T)单一突变69例，katG315(AGC→ACC)联合inhA-15(C→T)5例，katG基因缺失6例，katG基因缺失联合inhA-15(C→T)1例。465例耐INH MTBkatG和inhA基因突变谱及突变率，见表1。

表1 465例耐INH MTBkatG和inhA基因突变谱及突变率

Tab.1 Gene mutation spectrum and mutation rate ofkatGandinhAresistance to INH from 465 examples

GeneLocusBasechangeMutationnumberMutationrate(%)katG315G→C36378.06G→A265.59deletion71.51inhA-15C→T7516.13

2.3 比例法检测结果 与基因芯片检测者为同一病人的同类型送检标本经罗氏培养后有1 493例MTB阳性，经比例法检测，INH耐药255例，敏感1 238例，耐药率为17.08%。

2.4 基因芯片和比例法检测INH耐药性结果的比较 以比例法结果为判断标准，255株耐药菌株中有218株经基因芯片法测定为INH耐药，37株检测为敏感；1 238株敏感菌株中1 207株经基因芯片法检测为敏感，31株检测为耐药菌株(见表2)。基因芯片法的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及准确性分别为85.49%(218/255)、97.50%[1 207/(31+1 207)]、87.55%[218/(218+31)]、97.03%[1 207/(37+1 207)]和95.45%[(218+1 207)/1 493]。

3 讨 论

结核病是由MTB感染所引发的一种慢性传染性疾病，目前全世界有1/3的人口存在潜在MTB感染，仅2007年就有927万新发病例[6]。耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现，掀起了结核病的第3次世界流行高峰(仅2007年全球MDR病例估计数就有50万之多)[6]，同时也严重阻碍了我国结核病防治工作的进程。INH的耐药性检测是MDR-TB和XDR-TB筛查的主要依据之一。目前分子药敏检测技术日益已成为MDR-TB和XDR-TB筛查的研究热点。

表2 基因芯片和比例法检测INH耐药性结果比较

Tab.2 Comparison of the results of gene chip and ratio to detect the resistance to INH

GenechipRatiodrugsensitivetestResistanceSensitivityResistance21831Sensitivity371207

基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的分子生物学技术。基因芯片技术是针对不同的基因突变，设计出不同的寡核苷酸探针，并固定在固相载体上，即基因芯片，同时采用PCR技术对含突变的基因片段进行扩增，将扩增片段与基因芯片进行杂交。只需少量样品一次杂交，即可获得该菌株对多种抗结核药物的耐药性结果。

研究表明，导致MTB对INH耐药的主要分子机制与katG、inhA、kasA、ndh、ahpC5种基因突变[7]或缺失有关，其中过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因katG和参与分枝菌酸生物合成的烯酰基还原酶编码基因inhA发生突变可以解释约80%以上的耐INH分离株[8]，kasA、ndh和ahpC3种基因突变仅占耐药机制中的不足20%。在本研究中，katG315(AGC→ACC)是最主要的突变类型，inhA-15(C→T)次之，突变率分别为78.06%(363/465)和16.13%(75/465)。本研究与乐军等的测序报道[9]基本相近。Bang等[10]对l 825例结核病患者的研究，katG315(AGC→ACC)和inhA基因启动子-15位(C→T)突变型分别占到INH高水平耐药和低水平耐药的84%。可以认为katG315(AGC→ACC)和inhA-15(C→T)是本地区INH耐药最主要的突变类型。但也有不同的报道，西班牙katG315密码子突变频率为34.6%[11]，而俄罗斯的这种突变频率高达93.6%[12]；对于inhA基因突变，吴雪琼[13]等人的实验结果为20%，朱中元[14]等人的研究结果则为65%。由此可见耐药基因突变具有明显的地区差异，因此，每个国家和地区的突变类型和频率资料通常不能应用于其他地区。

在本研究中，还发现katG315(AGC→ACC)联合inhA-15(C→T)的突变类型，以及katG基因缺失和katG基因缺失联合inhA-15(C→T)的突变类型。联合突变报道较为常见，但katG基因缺失以及与inhA-15(C→T)联合突变报道则并不多见，国内吴雪琼[13]、陈杨[15]等也曾有katG基因缺失的发现，认为此基因缺失也是导致MTB对INH产生耐药的分子机制之一。

为了进一步验证基因芯片检测INH对MTB耐药性结果的敏感性和特异性，我们用与基因芯片检测相同病人的同期送检同类型标本的培养阳性菌株做比例法药物敏感性试验，比较两种方法的符合性，结果如表2所示，二者具有较高的符合率，这与我们前期的研究结果[16]基本一致。

INH耐药机制复杂多样，涉及多个基因的多个突变位点，并不时发现有新的耐药基因与突变位点，基因芯片因受其载量的限制，不能包罗INH耐药的所有基因突变类型，这是基因芯片技术的不足，但通过大样本检测了解本地区INH相关耐药基因的主要突变特征，选用适合本地区的基因芯片，对INH耐药性的快速检测仍具有重要意义。

综上所述，本地区INH耐药以katG315(AGC→ACC)和inhA-15(C→T)突变类型为主，基因芯片对MTB INH耐药性检测与比例法比较，具有较高的敏感性、特异性和准确性，可用于本地区MTB INH耐药性的快速检测。

[1]Aziz MA, Wright A, Laszlo A, et al. WHO/international union against tuberculosis and lung disease global project on anti-tuberculosis drug resistance surveillance. Epidemiology of antituberculosis drug resistance(the Global Project on Anti-tuberculosis Drug Resistance Surveillance): an updated analysis[J]. Lancet, 2006, 368(9553): 2142-2154.

[2]Afanas’ev MV, Ikryannikova LN, Il’ina EN, et al. Molecular characteristics of rifampicin- and isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from the Russian Federation[J]. J Antimicrob Chemother, 2007, 59(6): 1057-1064.

[3]Minime-lingoupou F, Pierre-audigier C, Kassa-Kelembho E, et al. Rapid identification of multidrug-resistant tuberculosis isolates in treatment failure or relapse patients in Bangui, Central African Republic[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2010, 14(6): 782-785.

[4]Ano H, Matsumoto T, Suetake T, et al. Relationship between the isoniazid-resistant mutationkatGS315T and the prevalence of MDR-/XDR-TB in Osaka, Japan[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2008, 12(11): 1300-1305.

[5]Wang SM, Zhu JH, Zhang LX. Clinical laboratory Procedures for tuberculosis Diagnosis[M]. Beijing: Chinese Education and Culture Publishing House, 2006: 30-51. (in Chinese) 王甦民, 朱建华, 张立兴. 结核病诊断实验室检验规程[M]. 北京: 中国教育文化出版社, 2006: 30-51.

[6]World Health Organization (2009): Global tuberculosis control-epidemiology, strategy, financing, WHO Report 2009[R]. WHO/HTM/TB/2009.411.

[7]Doustdar F, Khosravi AD, Farnia P, et al. Molecular analysis of isoniazid resistance in different genotypes ofMycobacteriumtuberculosisisolates from Iran[J]. Microb Drug Resist, 2008, 14(4): 273-279. DOI: 10.1089/mdr.2008.0842

[8]Jiao WW, Mokrousov I, Sun GZ, et al. Molecular characteristics of rifampin and isoniazid resistantMycobacteriumtuberculosisstrains from Beijing, China[J]. Chin Med J, 2007, 120(9): 814-819.

[9]Yue J, Zhang M, Zhang HM, et a1. Molecular characterization of mutations associated with isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2006, 26(10): 950-955. (in Chinese) 乐军, 张旻, 张红梅, 等. 结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药相关基因突变的分子特征[J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 2006, 26(10): 950-955.

[10]Bang D, Andersen PH, Andersen AB, et al. Isoniazid-resistant tuberculosis in Denmark: mutations, transmission and treatment outcome[J]. J Infect, 2010, 60(6): 452-457. DOI: 10.1016/j.jinf.2010.03.017

[11]Kim SY, Park YJ, Kim WI, et al. Molecular analysis of isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates recovered from south Korea[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2003, 47(3): 497-502.

[12]Mokrousov I, Narvskaya O, Otten T, et al. High prevalence ofkatGSer315Thr substitution among isoniazid-resistantMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from northwestern Russia, 1996 to 2001[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46(5): 1417-1424.

[13]Wu XQ, Zhong M, Zhang JX, et al. Analysis ofKatGgene mutations inM.tuberculosisisolates by direct sequencing[J]. J Clin Lab Sci, 2000, 18(1): 9-11. (in Chinese) 吴雪琼, 钟敏, 张俊仙, 等. PCR直接测序法分析结核分枝杆菌katG基因突变[J]. 临床检验杂志, 2000, 18(1): 9-11.

[14]Zhu ZY, Shao HS, Chen YF, et al. Sequencing ofinhAin drug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates[J]. Chin J Tuberc Respir Cis, 2001, 24(1): 48-51. (in Chinese) 朱中元, 邵寒霜, 陈允凤, 等. 结核分枝杆菌inhA基因突变的测序研究[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2001, 24(1): 48-51.

[15]Chen Y, Chen L, Zhang H, et al. Study of the relationship between resistant to isoniazid and mutation ofKatGandinhAinMycobacteriumtuberculosisisolates[J]. Chin J Antibiot, 2010, 35(10): 788-792. (in Chinese) 陈杨, 陈玲, 张泓, 等. 耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的研究[J]. 中国抗生素杂志, 2010, 35(10): 788-792.

[16]Ou WZ, Luo KW, Wang Y, et al. The comparative study of gene chip and ratio drug sensitive test in detectingMycobacteriumtuberculosisresistance to rifampin and isoniazid[J]. Lab Med, 2013, 28(5): 404-407. (in Chinese) 欧维正, 骆科文, 王燕, 等. 基因芯片和比例法药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究[J]. 检验医学, 2013, 28(5): 404-407.

Determination of resistance genesKatGandinhAinMycobacteriumtuberculosisisolates from Guizhou Province by gene chip

OU Wei-zheng1,CHEN Zheng-hong2,CHEN Jing1,LUO Ke-wen1,WANG Yan1,QIN Wan1,MENG Jun1

(1.GuiyangPublicHealthTreatmentCenter,Guiyang550003,China;2.DepartmentofPathogenicBiology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

We aimed to investigate the characteristics ofKatGandinhAgene mutations ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) associated with INH in Guizhou Province, and to evaluate the clinical application value of gene chip in MTB resistance detection. Resistance to INH of 2 738 clinical samples were detected by gene chip method. These samples were determined as MTB positive by PCR-fluorescent probe method. Characteristics of mutations of INH resistance geneKatGandinhAwere then analysed. Meanwhile, MTB were isolated from these samples by Lowenstein-Jensen method and INH resistance were detected by ratio method. Susceptibility results determined by these two methods were compared. Of 465 samples in 2 738 MTB nucleic acid positive samples were resistant to INH determined by gene chip method, and the rate was 16.98%. Gene mutations were mainly found inkatG315(AGC→ACC)and the mutation frequency was 78.06%. TheinhA-15 (C→T) mutation was in the second place and thekatG315 (AGC→AAC) was in the third place, and the mutation frequency was 16.13% and 5.59%, respectively. A total of 1 493 MTB strains were isolated from the same samples of the above patients. Being determined by conventional ratio method, 255 MTB strains were detected as resistant to INH, with the rate of 17.08%. INH resistance was judged according to the conventional method, and the sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), and accuracy of the gene chip method was 85.49%, 97.50%, 87.55%, 97.03% and 95.45%, respectively. In conclusion, gene mutations related with MTB resistance to INH were mainly happened at theKatG315 (AGC→ACC) and theinhA-15 (C→T) in Guizhou Province. Gene chip is a rapid test method with high sensitivity, specificity and accuracy, which could be used in the fast detection of the MTB drug resistance to INH.

gene chip; isoniazid; gene mutation; ratio drug sensitive test;Mycobacteriumtuberculosis

Chen Jing, Email:chenjingfk@sina.cn

陈静，Email：chenjingfk@sina.cn

1.贵阳市公共卫生救治中心，贵阳 550003； 2.贵阳医学院微生物学教研室，贵阳 550025

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.013

R378.91

A

1002-2694(2015)07-0655-04

2014-12-08；

2015-05-19

贵州省社会发展攻关项目(黔科合SY字[2013]3060号)；贵阳市社会发展与民生科技项目(筑科合同[2013103]14号)

Supported by the Brainstorm Project on Social Development in Guizhou Province (Guizhou Science Contract No.[2013]3060) & the Project on Social Development and Science and Technology for People’s Livelihood in Guiyang City (Guiyang Science Contract No.[2013103]14).