中国西部人群PARP－1基因SNP位点多态性与胰腺癌易感性的关系＊

李汛 张奇煜 严俊 何雯婷 周文策 张磊 孟文勃 白仲添 朱克祥 朱晓亮

（兰州大学第一医院普外二科·甘肃省肝胆胰外科研究所，甘肃兰州730000）

胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）是一种高度恶性肿瘤，5年生存率不足5%［1］，是目前预后最差的肿瘤。胰腺癌的病因尚未完全明了，大量证据表明遗传因素和环境因素的协同作用是胰腺癌发生的主要原因［2］。资料表明，某些肿瘤相关基因的多态性与胰腺癌的发病风险相关，有助于早期发现胰腺癌［3］。聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶－1（polymerase－1，PARP－1）具有保持染色体结构的完整、参与DNA复制和转录的功能，在维持基因组稳定和细胞死亡过程中发挥作用。PARP－1存在多个多态性位点，目前对于PARP－1的SNPs与肿瘤的易感性的研究，主要集中生殖系肿瘤、肺癌和胃癌方面，但有关PARP－1的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与胰腺癌易感性的关系文献报道较少。本文通过检测胰腺癌患者PARP－1基因的多态性，并与良性对照组作比较，以探讨PARP－1基因SNP多态性与胰腺癌的发病风险关系，寻求胰腺癌早期诊断的分子标记。

1 资料与方法

1.1 研究对象 胰腺癌组选择2008年1月～2011年3月于兰州大学第一医院普外科住院患者，行手术治疗并经术后病理证实胰腺癌66例，其中男性44例，女性22例。年龄36～75岁，平均（57.9±11.2）岁；对照组：选择同期良性胰腺疾病患者85例，男性45例，女性40例，年龄22～85岁，平均年龄（56.3± 13.4）岁。并获得其同意，调查研究对象的流行病学资料，采集以下信息：①人口学特征，如年龄、性别等。②病史及药物使用情况。③吸烟史和饮酒史。④癌症家族史：研究对象至少有一个直系亲属（包括父母、兄弟或姐妹）是癌症患者，被认为是有家族史。纳入和排除标准同前述。患者一般资料，见表1。

表1 两组患者的一般特征比较［n（×10－2）］Table 1 The general data of the patients

1.2 方法

1.2.1 试剂及标本 血液DNA抽提试剂盒、iPLEX反应试剂、384－well SpectroCHIP生物芯片、HOTSTART taq酶、SAP酶、纯化琼脂等。研究对象抽静脉血5ml（EDTA抗凝），－70℃保存。提取全血基因组DNA，用于SNP位点检测。

1.2.2 PARP－1 Val 762Ala（T2444C）多态性基因检测SNP分型 采用美国Sequenom公司的Mass ARRAYTM Analyzer技术平台进行SNP检测：①设计合成引物：通过PCR扩增、PCR引物和单碱基延伸引物均由Assay Designer（Sequenom）软件包设计。引物合成由深圳华大生物工程技术服务有限公司完成。所有DNA样本稀释到5 mg／L后，取1μl，将其与0.95μl水、0.625μl PCR缓冲液（含2 mmol／L MgCl2）、1μl的2.5 mmol／L d NTP、0.4μl的25 mmol／L MgCl2、1μl PCR引物以及0.1μl HotStar Taq酶（Qiagen）混合在一起。PCR反应条件：94℃，15min；94℃，20 s；56℃，30 s；72℃，1 min；共45个循环；最终72℃3 min。②SAP酶处理，降解扩增用的d NTP：PCR扩增后，剩余的d NTP将被去磷酸消化掉，反应体系包括1.53μl水、0.17μl SAP缓冲液、0.3μl碱性磷酸酶，该反应在37℃进行40 min，然后85℃，5 min使酶失活。③延伸引物单碱基延伸反应程序：碱性磷酸酶处理后，针对SNP的单碱基延伸引物在下列反应体系中进行：0.619μl水、0.2μl 10×iPLEX缓冲液、0.2μl终止混合物、0.041μl iPLEX酶，0.94μl的10μmol／L延伸引物.单碱基延伸反应在下列条件下进行：94℃，30 s；94℃，5 s；52℃，5 s；80℃，5 s；5个循环，共40个循环；最后72℃，3 min。④树脂除盐纯化：在终止反应物中加入6 mg阳离子交换树脂脱盐，混合后加入25μl离子水悬浮，离心5min（3000rpm）。⑤质谱检测：使用Mass ARRAY Nanodispenser将最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP（Sequenom）上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行分析，最终结果由Mass ARRAYRT软件系统（版本号4.0）实时读取，并由Mass ARRAY Typer软件系统（版本号4.0）完成基因分型分析。5%的样本随即接受重复检测，以验证检测的重复性及稳定性。

1.3 统计学处理 所用统计学分析软件为SPSS 13.0，分类变量和基因分型在两组中的分布差异用χ2检验。检验水准为5%。以非条件logistic回归计算比值比（odds ratio，OR）及其95%可信区间（confidence interval，CI）评价各基因型及单体型与胰腺癌发病风险的关系。所有统计检验均为双侧检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

实验检测的PARP－1 Val762Ala（T2444C）有TT、CT、CC 3种基因型。以野生型TT为对照，TC基因型与胰腺癌发病风险增高相关（OR 2.476，95% CI：1.159～5.292，P＝0.018）；CC基因型与胰腺癌发病风险增高相关（OR 5.778，95%CI：2.278～ 14.657，P＜0.001）；P ARP－1 2444 C等位基因（CT＋CC）个体患胰腺癌的风险是野生型者的3.377倍（OR 3.377，95%CI：1.715～6.646（P＜0.001），见表2。

表2 PARP－1 Val762Ala（T2444C）基因型分布和胰腺癌危险性的关系Table 2 Relation of genotype of PARP－1 Val762Ala（T2444C）and risk of pancreatic cancer

3 讨论

目前普遍认为，胰腺癌的发病同多数恶性肿瘤一样，是遗传因素和环境因素共同作用的结果，环境致癌物及／其代谢产物攻击机体细胞引起DNA损伤。当DNA损伤不能及时有效地修复，积累到一定程度导致基因组不稳定性升高，引起细胞增殖和分化失控，导致肿瘤的发生。研究表明DNA修复能力的差异是决定肿瘤易感性的重要因素。DNA修复基因的变异可影响DNA修复能力，从而影响肿瘤在人群中的发病风险［4，5］。

PARP家族共有7个成员，PARP－1是第一个被发现和研究得最清楚的一个成员。在PARP－1的17号外显子第2444位核苷酸由T至C的转换导致了第762位的氨基酸由Val突变为Ala。第762位氨基酸位于PARP－1的酶接触反应区，在多种物种中都是高度保守的。研究表明PAPR－1基因Val762Ala（T2444C）的多态性可增加食管癌、肺癌、胃癌的发病风险［7～9］。Lockett［10］研究显示Val762Ala的Ala的Ala／Ala基因型能增加前列腺癌的发病风险，降低酶的活性。通过数据分析，本组发现 PARP－1 Val762Ala（T2444C）多态性与胰腺癌的发病风险相关，PARP－1 2444 TC基因型个体患胰腺癌的风险是野生型TT携带者的2.476（OR 2.476，95%CI：1.159～5.292，P＝0.018）；CC纯合突变型个体患胰腺癌发病风险是野生型TT携带者的5.778倍（OR 5.778，95%CI：2.278～14.657，P＜0.001）；PARP－1 2444 C等位基因（CT＋CC）个体患胰腺癌的风险是野生型者的3.337倍（OR 3.337，95%CI：1.715～6.646，P＜0.001）（OR 0.382，95%CI：0.204～0.715，P＝0.002）。研究表明PARP－1Val762Ala的多态性可降低PARP－1活力的40%［11］，导致修复DNA损伤的能力降低，从而可能增加个体对胰腺癌发病的易感性。本研究有待进一步扩大样本量在不同地域人群中进行深入研究和讨论，最终确定PARP－Val762Ala（T2444C）能否作为胰腺癌的一个易感性标志物。

4 结论

本文结果显示PARP－1 Val762Ala（T2444C）单核苷酸多态性与胆管癌易感性相关，C等位基因型携带者患胰腺癌风险较高，PARP－1 Val762Ala（T2444C）单核苷酸多态性可作为预测胰腺癌的生物标志物。

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