大鼠视神经的发育学研究＊

何家全 杨忠 蔡文琴

（1.川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院神经外科，四川南充637000；2.第三军医大学基础部组织胚胎学教研室，重庆400038）

视神经是视觉传导的通路，属中枢神经，由视网膜节细胞发出的神经纤维及神经胶质细胞组成，不含神经元胞体，因此常用作中枢神经损伤再生研究较理想的实验材料［1、2］，但有关不同发育阶段大鼠视神经的变化目前还未见系统报道。本研究从组织形态学的角度，采用常规HE及免疫组织化学染色，结合电镜技术，通过对不同发育阶段大鼠视神经的观察，以期揭示其变化规律，为进一步进行有关视神经的研究提供实验资料。

1 材料和方法

1.1 动物及主要试剂来源 实验动物由第三军医大学动物实验中心提供成年Wistar品系大鼠，种鼠按雄：雌1∶2笼养交配，次晨检查出现阴栓为妊娠零天。实验试剂为抗CNPase单抗（2′3′－cyclic nucleotide 3′－phosphohydrolase，CNPase，Promega公司）用于标记整个发育阶段的少突胶质细胞，抗GalC（Galactocerebroside GalC，Sigma公司）多抗用于标记成熟的少突胶质细胞。抗胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP，重庆医科大学）单抗用于标记星形胶质细胞。SP免疫组化试剂盒为北京中山公司产品。

1.2 分组与检测方法

1.2.1 动物分组及取材 按产后（postnatal）0、3、5、8、15、20、90天平均分成7组，分别命名为P0d、P3d、P5d、P8d、P15d、P20d及P90d，每组4只。其中HE染色、抗CNPase、GalC和GFAP免疫组化染色2只，电镜2只。动物断头后1分钟内用显微手术器械于视交叉向前一直达眼球完整取出视神经。电镜标本放入3%的戊二醛中固定，HE及免疫组化染色标本放入4%的多聚甲醛／PB中固定，常规石蜡包埋切片。

1.2.2 免疫组化染色观察 操作步骤按说明书进行，只作少许修改，即石蜡切片常规脱蜡至水，3% H2O2／甲醇10min，PBS洗3min×3次，7%山羊血清／PBS室温孵育30min，CNPase（1∶1000）单抗，GalC多抗（1∶100）及GFAP单抗（1∶100）4℃过夜，PBS洗5min×3次，生物素化IgG（1∶200）37℃6h，PBS 5min ×3次，HRP标记的链霉卵白素（1∶200）37℃2h，PBS 5min×3次后，DAB显色光镜观察。

1.2.3 发育大鼠视神经HE染色按常规进行电镜观察、常规包埋后切片，电子染色，透射电镜观察。将HE染色及GFAP和CNPase、GalC染色结果照相，然后换算成相同放大倍数（×200），每张照片（5吋）分别随机统计4个相同面积（4cm2）内阳性细胞数，每种染色在相同时相点统计两张照片（n＝8），统计时按照体视学的原则，对于统计格内框格线上的细胞进行数上不数下，数左不数右；HE染色切片则统计相同情况下蓝染细胞核的数目，以此作为视神经内胶质细胞的总数。

1.3 统计学分析 所得数据用SPMR数理统计程序包在计算机进行双因素方差分析，所用程序为MANOVA，结果以±s标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电镜观察 大鼠出生后1天的视神经内细胞排列不规则，核多呈圆形，有的细胞内胞浆较丰富，粗面内质网、线粒体及高尔基氏体较发达，异染色质相对较多；另有一些细胞质内电子密度相对较低，有时可见成束的胶质原纤维，细胞核相对较大，异染色质相对较少，此类细胞相对较前一类为多。细胞间有大量的轴突，不见明显的髓鞘形成。出生后3天，细胞的数量有所增加，细胞的排列趋于规则，即细胞沿视神经长轴平行排列，与纤维相间。胞体稍有增大，胞质内细胞器仍较丰富，异染色质较多的细胞比例有所增加，轴突似可见单层的髓鞘。出生后5天，异染色质较多的细胞明显增多，细胞排列更规则，胞质显著减少，胞核拉长变扁，纤维区出现散在髓鞘包绕的轴突（见图1）。以后这种变化越来越明显，到出生后3月，可见细胞体积相对较小，胞质内仍可见较多的高尔基氏体和丰富的粗面内质网；细胞核长方形，常偏位；轴突均为髓鞘所包绕，已少见到胞质内有胶质原纤维的细胞，见图2。

图1 出生后5天大鼠视神经电镜示散在髓鞘形成（×5K）Figure 1 Partial myelination of optic nerve 5 days postnatal

图2 出生后3月大鼠视神经电镜示髓鞘形成完成（×20K）Figure 2 Completed myelination of optic nerve 3 months postnatal

2.2 HE染色光镜观察 大鼠出生后1天，视神经组织内细胞散在，较少，排列不规则；出生后3天，细胞数量明显增多（见图3）；出生后5天，细胞排列渐规则，细胞数量的增幅明显减小；至出生20天后细胞排列规则，见图4。

图3 HE染色示出生后3天大鼠视神经内细胞数明显增加（×200）Figure 3 Obviously increased cell number of optic nerve 3 days postnatal

图4 HE染色示成年大鼠视神经内细胞数显著增多（×200）Figure 4 Significant increase of cell number in adult rats

2.3 CNPase及GalC免疫组化染色 大鼠出生后1天，视神经内均未见GalC免疫染色阳性细胞，而只有极少数的CNPase免疫反应阳性细胞，排列不规则（见图5）。到出生后5天，两种抗体均为阳性的细胞数已显著增多，排列也趋于规则，于出生后15天，细胞数量的增长已显著放慢，并沿视神经的长轴平行排列，见图6。

2.4 GFAP免疫组化染色 大鼠出生后前3天，有较多的GFAP免疫反应阳性细胞（见图7），8天后，GFAP免疫反应阳性细胞数量较新生大鼠显著减少，到出生后3月，GFAP免疫反应阳性细胞已较少见到，见图8。

图5 GalC免疫组化染色示新生大鼠视神经内少突胶质细胞极少（× 200）Figure 5 Few oligodendrocyte in the optic nerve of newborn rat

图6 GalC免疫组化染色示成年大鼠视神经内少突胶质细胞多（× 200）Figure 6 Large Number oligodendrocyte in the optic nerve of adult rat

图7 GFAP免疫组化染色示新生大鼠视神经内星形胶质细胞较多（×200）Figure 7 More astrocyte in the optic nerve of newborn rat

图8 GFAP免疫组化染色示成年大鼠视神经内星形胶质细胞极少（× 200）Figure 8 Few astrocyte in the optic nerve of adult rat

2.5 不同发育阶段视神经内两种大胶质细胞的统计学变化 大鼠出生后3天，视神经内细胞总数较出生时有显著增加（P＜0.05），以后其增加速度迅速减慢，但成年大鼠视神经内的细胞数较出生后20天仍有一定程度的增长。CNPase免疫反应阳性细胞在出生后3天显著增加（P＜0.05），同时，GalC免疫反应阳性细胞也迅速增加（P＜0.05），到出生后20天，相同面积内CNPase免疫反应阳性细胞数与GalC免疫反应阳性细胞数已无显著差别（P＞0.05）。相反，GFAP免疫反应阳性细胞虽然在出生后3天有一定程度的增加，但出生5天后其数量即迅速减少，至成年后便维持在一定水平，见表1

3 讨论

中枢神经系统胶质细胞的分类复杂，根据其大小、形态、功能及免疫学特性就可分为很多种。其中两种大胶质细胞，少突胶质细胞和星形胶质细胞，在中枢神经系统中所占的比例最大，且生物学作用也非常重要。因此，本研究主要就这两种胶质细胞进行了观察。

表1 发育大鼠视神经内各细胞成分相对数量的变化Table 1 Changes of the cell number of optic nerve in the developmental rats

目前，鉴定星形胶质细胞及少突胶质细胞的方法也有多种，包括光镜及电镜方法。电镜对组织结构的细微变化观测有着不可替代的优越性，通过对电镜下某些细胞所表现出的特征性结构的认识，可以达到对这些细胞进行初步定性的目的［3］。而在光镜下，免疫组化染色不仅可对细胞进行较准确的定性，从而对细胞进行较准确的分类计数，而且在一定程度上还可对细胞内某些代射产物进行定量检测。本研究正是基于这样的事实，综合运用常规HE染色、免疫组化及电镜技术，对不同发育阶段大鼠视神经进行了比较系统的观察。

本研究结果显示，新生大鼠的视神经内可见大量平行排列的视网膜节细胞轴突，不见明显的髓鞘形成，其髓鞘是在出生后5天才逐渐形成的，这与Schwab等（1989）在皮质脊髓束中观察到的基本一致。视神经中各细胞成份的统计学显示，视神经中相同面积内的细胞总数在出生后的最初3天变化比较明显，即在出生后3天之内，细胞总数迅速增加，以后则变化明显放慢。同时，视神经中两种主要的细胞成份少突胶质细胞及星形胶质细胞的数量各自向着相反的方向变化，即在较短的时间内少突胶质细胞的数量迅速增加，而星形细胞的数量迅速减少。在出生后3天，视神经中不仅CNPase免疫反应阳性细胞数迅速增加，而且还出现了较多GalC免疫反应阳性细胞（P＜0.05），这种GalC免疫反应阳性细胞随着视神经的发育成熟，其比例也逐渐接近CNPase免疫反应阳性细胞，也就是说，视神经不断发育成熟伴随着少突胶质细胞的发育成熟［5，6］。

早些时候Jakson［7］及Dentinger［8］等采用先在光镜下数单位面积内细胞的总数，再在电镜下鉴定细胞类型的方法对发育大鼠视神经内各细胞成份的变化进行了类似的研究。其结论是：视神经在出生后的发育中细胞的总数有逐渐减少的顷向，并认为少突胶质细胞的比例在出生后虽迅速增加，但星形细胞却终保持着较高的比例，在成年动物差不多为1∶1，这与本实验结果有较大的偏差。Burne等［9］直接在电镜下进行细胞分类计数，结果是少突胶质细胞：星形胶质细胞为2∶1的比例。也有研究发现，随着视神经的发育成熟，神经纤维会逐渐减少，髓鞘形成细胞逐渐增多［10］。笔者认为，这与其计数及鉴定方法有关。由于电镜的放大倍数较大及少突胶质细胞多形性，因此，很难对细胞进行比较精确地计数。本实验采用少突胶质细胞及星形胶质细胞特异性标记物对细胞进行免疫组织化学染色并在光镜下观测，极大地避免了分类上的误差；另外，考虑到在视神经的发育过程中，随着视神经髓鞘的形成，其直径也要增粗，因此，在统计相同面积内的细胞数时，用视神经的直径对这些数字进行修正，从而更真实地反映了发育大鼠视神经中各细胞成份的变化规律。

4 结论

本研究从组织形态学上初步阐明了发育大鼠视神经的变化规律，即视神经发育成熟的过程是由少突胶质细胞逐渐形成髓鞘的过程，这一结果可为有关视神经的研究提供实验资料。

［1］ Lazarov－Spiegler O，Solomon AS，and Schwartz M.Peripheral nerve－stimulated macro－phages simulate a peripheral nervelike regenerative response in rat transected optic nerve［J］. Glia，1998，24（3）：329－337.

［2］ Mac Laren RE.Regeneration and transplantation of the optic nerve：developing a clinical strategy［J］.Br.J.Ophthalmol，1998，82（5）：577－583.

［3］ McCarthy KD，And Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures form rat cerebra［J］.J. Cell Biology，1980，85（3）：890－902.

［4］ Schwab ME，and Schnell.Region－specific appearance of myelin constitutents in the developing rat spinal cord［J］.Journal of Neurocytology，1989，18：161－169.

［5］ Ono K，Yokota S，Tsumori T，et al.Development of macroglial cells in the embrayonic chick optic nerve［J］.Brain Rev Dev Brain Res，1999，118（1－2）：211－215.

［6］ Dakubo GD，Beug ST，Mazerolle CJ，et al.Control of glial percursor cell development in the mouse optic nerve by sonic hedgehog from retinal ganglion cells［J］.Brain Res，2008，1228：27－42.

［7］ Jakson KF and Duncan ID.Cell kinetics and cell death in the optic nerve of the myelin deficient rat［J］.Journal of Neurocytology，1988，17：657－670.

［8］ Dentinger MP，Barron KD，and Csiza CK.Glial and axonal development in optic nerve of myelin deficient rat mutant［J］. Brain Research，1985，344：255－266.

［9］ Burne JF，Staple JK，and Raff MC.Glial cell are increased proportionally in transgenic optic nerves with increased numbers of axons［J］.J.Neurosci，1996，16：2064－2074.

［10］ Bennis M，Reperant J，Ward R，et al.The postnatal development of the optic nerve of a reptile（Vipera aspis）：A quantitative ultrastructural study［J］.Anat Embryol（Berl），2006，211（6）：691－705.