紫丁香蘑菌丝体液体发酵培养基的筛选

薛春梅， 李男男， 赵永勋， 李环明， 邵德福， 李佳琳， 杜春梅， 李 丽， 董锡文

(佳木斯大学生命科学学院， 黑龙江佳木斯 154007)



紫丁香蘑菌丝体液体发酵培养基的筛选

薛春梅， 李男男， 赵永勋， 李环明， 邵德福， 李佳琳， 杜春梅， 李 丽， 董锡文

(佳木斯大学生命科学学院， 黑龙江佳木斯 154007)

摘要[目的] 选出适合紫丁香蘑(Lepista nuda) 菌丝生长的液体发酵培养基。[方法] 以紫丁香蘑菌丝体干重和胞外糖含量为评价指标，通过正交试验筛选出最适合紫丁香蘑菌丝生长的液体发酵培养基。[结果] 碳源对菌丝体生长的影响最大，其次是KH2PO4和氮源，最后是MgSO4。[结论] 最适液体发酵培养基为：可溶性淀粉2%(w/V)，酵母浸粉0.5%(w/V)，KH2PO40.3%(w/V)，MgSO40.05%，CaCl20.001%，VB10.001%(w/V)，pH 7。

关键词紫丁香蘑；菌丝；液体发酵

Selection of Culture Medium for Liquid Fermentation ofLepistaNudaMycelium

XUE Chun-mei, LI Nan-nan, ZHAO Yong-xun et al(College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007)

Abstract[Objective] The research aimed to select the culture medium for liquid fermentation most suitable for the growth ofLepistaNudamycelium. [Method] We tried to select the culture medium for liquid fermentation most suitable for the growth ofLepistaNudamycelium through orthogonal test, by measuring dry weight ofLepistaNudamycelium and extracellular sugar content. [Result] The effect of the mixture of carbon source and KH2PO4.on the growth of mycelium was less than carbon source, but greater than that of MgSO4. [Conclusion] The most suitable culture medium is as follows: soluble starch2%(w/V), yeast extract powder 0.5%(w/V)，KH2PO40.3%(w/V)，MgSO40.05%，CaCl20.001%，VB10.001%(w/V)，pH 7。

Key wordsLepistaNuda；Mycelium; Liquid fermentation

紫丁香蘑(Lepistanuda)属于担子菌亚门(Basidiomveomveotina)层菌纲(Hymenomyeetes)伞菌目(Agaricales)口蘑科(Trieholomataeeae)香蘑属 (Lepista)，主要分布于中国、欧洲等地[1]。它是一种名贵的药食皆用的野生真菌。紫丁香蘑野生真菌在黑龙江省分布范围较广[2]，但是数量稀少，更由于长期、大量的采摘，野生存留量已呈逐年递减趋势。因此，紫丁香蘑价格昂贵，是一种具有开发潜力的野生真菌。

紫丁香蘑具有较高的药用价值和保健价值。其子实体含VB1、硬脂酸、神经酞胺和麦角固醇类等化合物。紫丁香蘑还具有很高的药用价值，对革兰氏阳性菌、阴性菌，小鼠肉瘤和艾氏癌具有良好的抑制作用[3-4]。有研究表明，紫丁香蘑提取物对小白鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率分别为90%和100%[5]。紫丁香蘑提取物能调节机体正常的糖代谢，促进神经传导[6-7]。此外，还具有抗炎、抗补体、免疫和促进血小板凝聚以及抗流感病毒等作用[8-9]。紫丁香蘑从栽培到产菇采收需要很长的时间，且菇体生长的环境温度较低，产量稀少，但它鲜嫩甜美，营养价值高，含有18种氨基酸，含钙、铁、磷、粗蛋白质、脂肪、多糖等多种营养物质。在欧洲，它的受欢迎程度与松茸、牛肝菌齐名，在法国被视为上等食材[10]。

目前，国内对紫丁香蘑液体发酵技术的研究较少。笔者以紫丁香蘑菌丝体液体发酵所需的碳源、氮源、无机盐为研究对象，筛选出最适合其生长的液体培养基。

1材料与方法

1.2试验方法

1.2.1培养基。

(1)斜面培养基。马铃薯20%(w/V)，蔗糖2%(w/V)，KH2PO40.2%(w/V)，琼脂2%(w/V)，MgSO40.1%(w/V)，VB10.001%(w/V)，pH自然。

(2)种子培养基。马铃薯20%(w/V)，蔗糖2%(w/V)，KH2PO40.2%(w/V)，MgSO40.1%(w/V)，VB10.001%(w/V)，pH自然。

(3)液体培养基。马铃薯20%(w/V)，碳源2%(w/V)，氮源0.5%(w/V)，KH2PO40.2%(w/V)，MgSO40.1%(w/V)，CaCl20.001%，VB10.001%(w/V)，pH自然。

1.2.2菌丝体分离。菌种分离采用组织分离法。选取生长健壮、菌柄粗壮、菌盖无病虫害的子实体。用浓度75%酒精棉球对子实体进行常规表面消毒后，用灭菌的小刀将其菌盖纵向切开，再用灭菌的手术刀将表皮与菌褶之间没暴露的组织切成小拇指指甲大小的一小块，将其接种在斜面培养基上，之后在25 ℃下培养，待其长满试管。

1.2.3菌种保存。将紫丁香蘑菌种置于4 ℃冰箱中保存，并且每1~3月用新鲜的培养基活化一次。菌种使用前先用新鲜培养基活化培养。

1.2.4培养方法。

在生物教学中，教学是以认知学习理论为基础的，是学生主动建构知识意义的过程，是以学生的学为中心的。这种以学生为中心，强调学生主动进行知识构建的教学设计，符合人本主义及素质教育的要求。作为教师，首先必须从思想上实现自身角色和行为的转变。在教学中，教师的教学行为转变主要体现在以下几个方面。

(1)菌种活化。将保存的菌种在28 ℃下培养1 d，在无菌条件下截取一小块约0.5 cm2，接种于试管中，于25 ℃培养，待菌丝长满管后备用。

(2)种子培养。在250 ml三角瓶中装入100 ml种子培养基，121 ℃高压灭菌30 min，冷却后，在无菌条件下接种4块约0.5 cm2于液体培养基中，然后在25 ℃、110 r/min的条件下摇床培养13 d。

(3)摇瓶培养。将种子液接入到液体培养基中，接种量为5%，于25 ℃、110 r/min的条件下摇床培养13 d。

1.2.5培养基的筛选试验。

(1)碳源的筛选试验。 以液体培养基为标准，分别设置蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、葡萄糖等5个碳源处理，另设不加碳源为对照。每250 ml三角瓶装100 ml培养基，接种量5%，于25 ℃、110 r/min培养13 d。试验重复3次。以菌丝体干重和胞外糖含量为评价指标，筛选出最佳碳源。

(2)氮源的筛选试验。 以液体培养基为标准，分别设置硝酸钾、硫酸铵、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨5个氮源处理，另设不加氮源为对照。每250 ml三角瓶装100 ml培养基，接种量5%，于25 ℃、110 r/min培养13 d。试验重复3次。以菌丝体干重和胞外糖含量为评价指标，筛选出最佳氮源。

(3)营养因素正交试验。以菌丝体干重为评价指标，根据单因素筛选试验结果，对最佳碳源、氮源、无机盐进行正交试验(表1)，以便筛选出最佳组合。

(4)初始pH筛选试验。以正交试验筛选出来的最佳组合为基础培养基，每250 ml三角瓶装100 ml培养基，用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl将发酵培养基的初始pH分别调至3、4、5、6、7、8、9、10共8个梯度。每个梯度重复3次。接种量5%，于25 ℃、110 r/min条件下培养13 d。以菌丝体干重和胞外糖含量为评价指标，筛选出最适初始pH。

表1　L9(34)正交试验设计　%

1.2.6液体发酵液中菌丝体的收集。将发酵后的菌丝体置于离心机中，4 000 r/min离心10 min，收集菌丝体沉淀，菌丝体用蒸馏水洗涤，重复3次，再用滤纸吸至不滴水。将所得菌丝体于55 ℃烘干至恒重，称重。

1.2.7胞外糖收集。将“1.2.6”中离心得到的滤液倒入旋转蒸发仪内，在80 ℃下逐渐浓缩至小体积，浓缩后的滤液以1∶2的比例加入浓度95%乙醇溶液，放入4 ℃冰箱中醇沉过夜，4 000 r/min离心10 min，沉淀物用无水乙醇、丙酮反复洗涤，得到胞外糖。干燥后，用电子天平称重。

2结果与分析

2.1不同碳源对紫丁香蘑菌丝体生长的影响由图1可知，在这些碳源中，以可溶性淀粉为培养基中的碳源，紫丁香蘑菌丝体干重和胞外糖含量相比于其他都较高，分别为3.951和4.653 g/L；菌球较大，且大小均匀，密度较高。所以，确定可溶性淀粉为紫丁香蘑菌丝体液体发酵培养的最适碳源。

2.2不同氮源对紫丁香蘑菌丝体生长的影响由图2可知，在这些氮源中，有机氮源比无机氮源更有利于紫丁香蘑菌丝体的生长，其中以酵母浸粉为培养基中的氮源，菌丝体干重和胞外糖含量相比于其他都较高，分别为3.171和2.905 g/L，菌球较大，且大小均匀，密度较高，所以确定可溶性淀粉为紫丁香蘑菌丝体液体发酵培养的最适氮源。

2.3不同营养因素正交试验由表2和表3可知，紫丁香蘑液体发酵所获得的最优组合为A2B2C3D1，此时获得的菌丝体干重为4.213 g/L，即优化后的最适培养基为可溶性淀

表2　不同营养因素正交试验

粉2%(w/V)，酵母浸粉0.5%(w/V)，KH2PO40.3%(w/V)，MgSO40.05%。由极差R值可知，影响紫丁香蘑菌丝产量的4个因素主次顺序为A>C>B>D。由方差分析可知，可溶性淀粉、酵母浸粉、KH2PO4和MgSO44个因素都达0.05显著水平。

2.4不同pH对紫丁香蘑菌丝体生长的影响由图3可知，紫丁香蘑菌丝体在偏酸、偏碱条件下几乎不生长，而在中性条件下菌丝体生长旺盛，菌丝体干重和胞外糖含量分别为4.333和4.957 g/L，所以确定紫丁香蘑菌丝体发酵培养的最佳pH为7。

表3　不同营养因素正交试验方差分析

3讨论

对紫丁香蘑菌丝体液体发酵培养基的筛选有利于菌丝体在液体发酵中的正常生长代谢，提高其产量，为后续的紫丁香蘑菌丝体的研究与开发提供资源保障。通过碳源、氮源、pH单因素试验，发现最佳碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为酵母浸粉，最佳pH为7。这与彭卫红等[11]报道的碳源和氮源对紫丁香蘑菌丝生长的影响研究结论相符。试验表明，有机氮比无机氮更利于其菌丝体的生长。这是因为有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸之外,往往还含有少量糖、脂肪、微量元素及维生素、生长素等物质,更有利于菌体的吸收。pH过低或过高可能致使培养基中某些重要的营养物质和中间代谢产物的离解,不利于菌丝体对这些物质的吸收和利用。pH的变化也会改变菌丝体各种酶的活性,影响细胞膜功能,使得细胞的形态和结构发生变化,从而影响菌体的生长和代谢产物的形成。正交试验结果表明，碳源对菌丝体生长的影响最大，其次是KH2PO4和氮源，最后是MgSO4；紫丁香蘑菌丝体生长的最适培养基为可溶性淀粉2%(W/V)，酵母浸粉0.5%(W/V)，KH2PO40.3%(W/V)，MgSO40.05%。 该试验只对紫丁香蘑菌丝体液体发酵培养基进行了初步的筛选，对培养温度、转速、接种量等有待进一步的研究。

参考文献

[1] 卯晓岚.中国大型真菌[M].郑州:河南科学技术出版社，2000:180.

[2] 邵力平.中国森林蘑菇[M].哈尔滨:东北林业大学出版社，1997：416-417.

[3] DULGER B，ERGUL C C，GUCIN F.Antimicrobial activity of the macrofungusLepistanuda[J].Fitoterapia,2002,73(7/8):695-697.

[4] 刘佳，高敏，向红，等.野生多汁乳菇抗辐射作用研究[J].中国公共卫生，2006，22(4)：453-454.

[5] 宋旭红，丁红，张月明，等.新疆阿魏蘑菇提取物抗肿瘤实验研究[J].营养学报，2002，24(2)：154-157.

[6] LEE Y S，HAN J Y，JOO E Y，et al.Study on the anti-tumor effects of extracts fromLepistanudemushroom [J].Journal of the korean society of food science and nutrition,2005,3(34):317-322.

[7] 卯晓岚.中国经济真菌[M].北京:科学出版社，1998：152.

[8] 应建浙,卯晓岚,马启明.中国药用真菌图鉴[M].北京:科学出版社，1987：128.

[9] LEE Y S，PARK D C，JOO E Y，et al.Study on the antioxidant activity of the extracts from theLepistanude[J].Journal of the korean society of food science and nutrition,2005,34(7):942-947.

[10] MURCIA M A,MARTINEZ T M,JIMENEZ A M,et al.Antioxidant activity of edible fungi(truffles and mushrooms):Losses during industrial processing[J].Journal of food protection,2002,65:1614-1622.

[11] 彭卫红，罗婷，甘炳成，等.碳源和氮源对紫丁香蘑菌丝生长的影响研究[J].西南农业学报，2004(17):419-422.

收稿日期2015-10-19

作者简介薛春梅(1975- )，女，黑龙江佳木斯人，副教授，硕士生导师，从事应用微生物学方面的研究。

基金项目黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531696)。

中图分类号S 646

文献标识码A

文章编号0517-6611(2015)33-011-02