保山野生美网柄牛肝菌的菌丝分离研究

余 丽 晏爱芬 王朝芳

（保山学院资源环境学院，云南保山678000）

祖国医学认为“药食同源，食药兼有”。美味牛肝菌不仅具有一定的营养价值，而且具有较高的药用价值。牛肝菌最早记载于古文献《滇南本草》中：气味微酸、辛，性平。主治清热解烦，养血和中。现代文献《中国药用真菌》《中国药用孢子植物》及《秦岭巴山天然药物志》中均提到该菌含有的多种生物碱可治腰腿疼痛、手足麻木、盘骨不舒、四肢抽搐以及妇女白带异常等症[1-3]。牛肝菌是一类珍稀大型菌根食用真菌，肉厚而细软、味道鲜美，富含蛋白质、多糖、纤维素、维生素、矿物质、氨基酸等物质，是我国重要的出口野生食用菌[3]。但野生菌受季节限制，不能常年为人们供应。目前商业贸易的美味牛肝菌全部来自于森林中采集的野生资源，世界各国都投入了大量的人力、物力和财力开展对其引种驯化和人工栽培方法的研究，但均没有获得子实体[4-5]。因此进行菌丝分离研究，实现人工栽培具有重要研究及应用的价值。研究通过对保山野生美味牛肝菌菌丝的分离培养，以期为美味牛肝菌的人工驯化提供基础。

图1 美网柄牛肝菌

1 材料与方法

1.1材料美网柄牛肝菌（Boletus reticulatus）别名白牛肝菌、大脚菇，图1，购买于保山市场。

1.2培养基①蛋白胨培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，KH2PO41 g，马铃薯200 g，琼脂20 g，H2O 1000 mL；②玉米粉培养基：葡萄糖20 g，玉米粉50 g，琼脂20 g，硫酸镁 1 g，磷酸氢二钾 1 g，硫酸钙 1 g，H2O 1000 mL；③改良PDA：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，硫酸镁1.5 g，琼脂20 g，H2O 1000 mL；④胡萝卜培养基：马铃薯20 g，胡萝卜20 g，琼脂20 g，H2O 1000 mL；⑤PDA：葡萄糖 20 g，马铃薯 200 g，琼脂 20 g，H2O 1000 mL；⑥马铃薯培养基：葡萄糖20 g，马铃薯200 g，硫酸镁 1.5 g，KH2PO41 g，酵母膏 2 g，琼脂20 g，H2O 1000 mL；⑦黄豆粉培养基：葡萄糖20 g，KH2PO41 g，酵母膏 7 g，黄豆粉 3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·H2O 0.5 g，琼脂20 g，H2O 1000 mL。

1.3接种培养材料处理：挑选新鲜、壮实、无虫害的野生子实体，去掉杂质后放置1～2 h，使菇体失去多余的水分，便于分离成功。

母种分离：用75%的酒精对菇体表面进行消毒。无菌条件下，以组织分离方法进行牛肝菌母种分离。将子实体纵剖为两半，用解剖刀分别切取野生美味牛肝菌菌柄最下部（接近菌根的地方）、菌柄中部、菌盖处、菌盖与菌柄交接处5个部位组织块分别放于上述5种培养基中，尽可能将组织块接入较多的斜面培养基。培养条件为28℃，无光照。4 d后开始观察记录，若有污染则及时剔除。

1.4菌丝生长观察待接种的组织块长出较多菌丝时用接种针挑取少量菌丝接种到七种培养基中28℃纯化培养，每两天观察一次，并记录其生长情况。通过菌落直径比较、菌丝生长比较，分析不同培养基对菌丝生长的影响。以确定下一步菌丝培养所用的培养基。

菌丝的纯化：选取经过纯化培养，生长状况良好的菌丝接种到适合菌丝生长的培养基上培养，每两天观察一次，并进行记录。

1.5菌种鉴定通过菌丝形态观察、研磨菌丝组织的气味对所分离的菌丝进行初步判断。在此基础上提取菌丝DNA进行ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定[6-7]，对分离所得美味牛肝菌菌丝进行种属鉴定。

2 结果与分析

2.1美味牛肝菌菌丝分离情况不同分离培养基的分离结果差别很大，经过接种培养发现黄豆粉培养基、玉米粉培养基、马铃薯培养基较其它培养基更适合组织块接种培养。培养到第10天可以看到在组织块表面有菌丝生长，菌丝较短白色；培养到第16天时可以明显看出菌丝已经生长很浓密，而且长势很好。美味牛肝菌不同部位组织接种培养后菌丝生长状况见表1、图2。

表1 美味牛肝菌子实体不同部位组织分离菌丝生长状况

图2 不同培养基中美味牛肝菌组织分离菌丝生长状况（左为培养10 d，右为培养16 d）

图3 菌丝在不同培养基中的生长状况（左为培养6 d，右为培养18 d）

2.2菌丝转接纯化挑取组织中生长健壮、颜色洁白的菌丝转接于新的培养基中进行纯化培养。从组织块上转接过来的菌丝培养三四天后开始长出菌丝，菌丝生长速度明显加快。在不同培养基中菌丝生长情况不同，在培养基②、⑤、⑥中菌丝紧紧贴附着培养基生长，菌丝短不易挑取；在培养基⑦中菌丝向上生长，菌丝也较长较粗壮易挑取。在菌丝生长后期会产生黄褐色的水珠状分泌物，有分泌物产生的培养基即使后期变干了也不会被污染，说明这种褐色分泌物对防止污染有一定作用，原因还有待进一步研究。第一次转接后美味牛肝菌在不同培养基中菌丝生长情况见表2、图3。

结果发现②、⑤、⑥、⑦四种培养基均适合菌丝生长，菌落在②培养基中生长最快，菌落面积最大，但是它的菌丝都附着在培养基表面生长，菌丝短而且不粗壮，从整体看⑦中的菌落虽然小但是菌丝明显优于其他的培养基，对菌丝生长而言是最适合的培养基。

挑取经第一次转接后的菌丝进行第二次转接，发现菌丝更容易存活生长也更好，这可能是因为第一次转接时菌丝从子实体组织块上取下来，还没有适应培养基，较难存活。而第二次转接时由于经过组织分离和第一次转接的驯化，已经能较好的适应人工培养基。取菌丝产生的组织进行培养也很容易存活，部分直接生长成组织，部分在组织外部生长出菌丝，菌丝与组织一起生长。如图4所示（左图为第二次转接菌丝生长情况，右图为生长后期出现组织分化）。

表2 菌丝转接在不同培养基中的生长状况

图4 第二次转接菌丝在不同培养基中的生长状况

图5 菌丝生长和组织分化（培养基⑦）

图6 Y5样品和Y1样品比对结果

为了更好的观察菌丝的生长，利用培养基⑦在生长面积较大的培养瓶或三角瓶进行菌丝的培养。从菌丝生长情况看，菌丝在生长初期洁白、浓密、粗壮，但生长后期同样也出现了组织分化，说明菌丝生长到一定程度开始分化（图5），在菌丝的保存上还需深入研究。

2.3菌丝的鉴定

2.3.1 形态观察 对生长良好的菌丝进行显微观察，发现作为担子菌的担子结构、锁状联合结构不是很明显。在对菌丝组织进行研磨时，散发出了浓郁牛肝菌香味，可初步判断该菌丝确为美味牛肝菌菌丝。

2.3.2 分子鉴定 对培养生长良好的美味牛肝菌菌丝进行DNA的提取（选取了编号为Y1和Y5的两个样，其中Y5直接从子实体取样，Y1是由Y5转接培养得到的菌丝），进行ITS（Internal Transcribed Spacer）鉴定，利用Basic Local Alignment Search Tool进行BLAST比对，比对结果如图6。

结果表明，Y1和Y5为同一个种，中文学名为美网柄牛柄菌，拉丁学名Boletus reticulatus Schaeff.中文别名（同物异名）Boletus edulis subsp.reticulatus（Schaeff）Konr，分类地位为伞菌目牛肝菌科牛肝菌属网柄牛肝菌（美味牛肝菌）。系统树构建如图7。

图7 系统树构建

3 小结与讨论

研究成功分离出美味牛肝菌菌丝，同时在培养基中后期生长已有组织分化。经ITS鉴定，结果为：中文学名为美网柄牛柄菌，拉丁学名Boletus reticu⁃latus Schaeff.中文别名（同物异名）Boletus edulis sub⁃sp.reticulatus（Schaeff.）Konr，分类地位为伞菌目牛肝菌科牛肝菌属网柄牛肝菌（美味牛肝菌）。

从表1、表2可以看出，研究所用的几种培养基中，加入了黄豆粉（⑦）、玉米粉（②）和马铃薯汁（⑥）的培养基相对而言更适合应用于美味牛肝菌菌丝的分离和培养，这主要是利用了天然成分黄豆粉、玉米粉和马铃薯中丰富的矿物质和维生素；三种培养基相比又以黄豆粉培养基⑦最适合菌丝生长，菌丝向上生长，菌丝粗壮，菌落边缘整齐圆形；而②和⑥培养基中菌落大，但菌丝生长地并不好，菌丝紧贴着培养基表面生长，菌丝短不易挑取。在⑦和⑥培养基中虽然都加入了酵母膏，但菌丝在⑦中生长要好于⑥。由此可见，在对美味牛肝菌菌丝分离培养中，黄豆粉和酵母膏对菌丝的生长有重要影响。在菌丝生长后期有部分菌丝出现组织分化，取这些组织进行接种培养很容易培养出菌丝，且不易受污染。

就目前对美味牛肝菌菌丝分离培养的研究虽然较多[8-11]，但成功率不高，同时人工驯化工作也十分艰难[12-13]的现状，研究在菌丝培养过程出现组织分化同时组织培养更易生长的现象，为下一步探讨人工培养提供了思路和依据。