过表达核糖核酸酶抑制因子对膀胱癌移植瘤侵袭转移及上皮细胞间质转化的影响＊

舒 静，姜 源，姚 雪，陈俊霞

（1．泸州医学院附属医院检验科，四川泸州646000；2．重庆市卫生信息中心《重庆医学》编辑部 401120；

3．重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室分子医学与肿瘤研究中心 400016）

膀胱癌是泌尿系统中常见的多发性肿瘤，位居世界恶性肿瘤的第5位。肿瘤侵袭转移是一个癌细胞与宿主细胞及基质相互作用的连续过程，即脱落、侵袭、循环、增殖形成肿瘤的转移灶。上 皮 间 质 转 化［1］（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是多细胞胚胎发育与器官形成中的基础过程，是胚胎发育中形态发生过程的主要部分，在EMT过程中上皮细胞获得间质细胞的特征——细胞间黏附减弱、运动性增强、细胞间基质降解等。近年来研究发现［2］，EMT在肿瘤发生、发展与转移过程中起着重要的作用，EMT使没有侵袭、迁移能力的细胞获得浸润能力并最终转移到其他组织和器官，并再次通过间质上皮转化定植形成转移灶。上皮标志物（E－cadherin）的下调与间质标志物（N－cadherin）的上调是EMT的主要特征之一。此外，锌指转录因子（Slug、Snail）也是EMT主要调节因子，通过与靶基因启动子结合，诱导EMT的发生，促使肿瘤细胞发生侵袭与转移［3］；而碱性螺旋环转录因子（Twist）通过抑制细胞凋亡与分化，诱导细胞上皮间质化转变，其高表达与肿瘤的转移与预后相关［4］。因此，本文通过构建裸鼠移植瘤模型，观察移植瘤的生长、微血管形成等，并检测移植瘤组织中侵袭转移、EMT相关分子蛋白的表达，研究核糖核酸抑制因子（ribonuclease inhibitor，RI）基因对膀胱癌T24细胞侵袭转移的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1．1 主要试剂及动物 人膀胱癌细胞株T24、pIRES2－EGFP、pIRES2－EGFP－RI质粒以及一抗（兔抗人RI）由重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室保存；BALB／C裸鼠5～6周龄，（20±3）g，购自北京大学动物实验中心；兔抗人CD31抗体购自美国Santa Cruz Biotech公司；Dylight 488标记的二抗（山羊抗兔IgG）购自北京鼎国公司；兔抗 E－cadherin、N－cadherin、MMP－2、MMP－9、Vimentin、Snail、Slug、Twist一抗购于 Bioworld公司；免疫组织化学染色试剂盒、DAB染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1．2 方法

1．2．1 T24细胞培养、转染及鉴定 用含10%FBS的RPMI－1640培养基培养于37℃、5%CO2培养T24细胞，取对数生长期细胞以每孔2×106细胞接种至6孔板中，待细胞融合度达70%，采用Lipofectamine 2000转染T24细胞。转染48h后用G418筛选，15d后采用有限稀释法获取单克隆细胞团。

1．2．2 裸鼠移植瘤模型 取0．1mL含有2×105／mL的各组对数期细胞，PBS制备细胞悬液后分别接种于裸鼠左腋皮下，每组8只。记录各组小鼠成瘤时间，21d后处死小鼠，称重并计算抑瘤率。抑瘤率＝（对照组肿瘤质量－实验组肿瘤质量）／对照组肿瘤质量×100%。

1．2．3 HE染色 4%多聚甲醛固定组织标本、5μm石蜡包埋切片、二甲苯脱蜡水化后苏木精染色4～5min、饱和碳酸锂分色5s，冲洗后伊红复染2min，梯度乙醇分别脱水1s，二甲苯透明后封片，在显微镜下对5个不同视野的高密度微血管区域进行计数。

1．2．4 免疫组织化学染色和免疫荧光分析 4%甲醛固定肿瘤组织、5μm石蜡包埋切片、二甲苯脱蜡水化及抗原修复、3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶及5%血清封闭，一抗孵育［RI（1∶250稀释）、Vimentin（1∶150稀释）、E－cadherin、N－cadherin、MMP－2、MMP－9、Snail、Slug、Twist（1∶200稀释）］于4℃冰箱中过夜；PBS清洗5min／次×3次，加入二抗生物素化羊抗兔IgG于37℃湿盒并孵育30min，加入辣根酶标记链酶卵白素溶液，37℃孵育10～20min，滴加DAB溶液，苏木精复染及封片，显微镜下观察拍片。组织免疫荧光：10μm冰冻切片，10%甲醛固定25min，2%Triton通透10min，BSA封闭25min，一抗CD31（1∶100稀释）于4℃孵育过夜，PBS洗3遍，加入二抗羊抗兔Dylight 488的IgG（1∶50）37℃避光孵育2h，PBS洗3遍，抗荧光淬灭剂封片。荧光显微镜下拍照，并分析瘤组织切片的荧光强度。

1．3 统计学处理 采用SPSS 11．5软件进行统计分析，实验数据以x±s表示，配对组间比较采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 过表达RI对T24裸鼠移植瘤生长的影响 裸鼠移植瘤生长结果：T24－RI［（0．080 833±0．072）g］组较 T24［（0．282 7±0．083）g］与T24－Vector［（0．273 5±0．174）g］组，瘤体质量显著降低（P＜0．05），抑瘤率分别为26．67%和38．85%。

2．2 过表达RI对T24裸鼠移植瘤微血管的影响 裸鼠瘤组织HE染色结果（图1）显示，与两对照组比较，T24－RI组移植瘤微血管明显少于两对照组（P＜0．01）。此外，组织免疫荧光结果也呈现相同趋势（图1－e），CD31抗体在T24－RI组中呈现弱阳性，而T24组及T24vector组呈强阳性。表明过表达RI基因抑制了肿瘤细胞的增殖及微血管的形成从而抑制肿瘤的生长。

2．3 过表达RI对T24裸鼠移植瘤肺部转移的影响 与两对照组比较，T24－RI组肺组织未见转移灶，而两对照组在血管周围均可见明显的细胞团－－细胞核增大、核染色加深且核质比例失调，表明已发生体内转移（图2）。

2．4 过表达RI对T24裸鼠移植瘤组织中侵袭转移相关蛋白

表达的影响 移植瘤组织免疫组织化学染色结果显示，与T24 vector组和T24组比较，T24－RI组RI、E－cadherin蛋白表达明显增加，而 N－cadherin、MMP－2、MMP－9、Vimentin、Snail、Slug、Twist蛋白表达明显降低（图3）。表明过表达的RI可以在裸鼠移植瘤组织中抑制侵袭转移关键蛋白的表达。

图1 各组移植瘤组织HE染色和免疫荧光CD31的微血管密度分析

图2 HE染色观察裸鼠瘤肺组织转移（×200）

图3 免疫组织化学染色观察各组移植瘤组织中RI、E－cadherin等蛋白的表达（×200）

3 讨 论

人核糖核酸酶抑制因子是一个分子量为50kD的胞浆内酸性糖蛋白，在核酸及蛋白质代谢中发挥重要的作用。RI是核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNaseA）的抑制剂，能与中性和碱性RNas A以等比的化学计量密切结合，从而抑制其酶活性。进一步研究表明［5］，RI是一个多功能的蛋白调节分子，可通过对RNase A的抑制引起RNA库的改变，进而影响蛋白质的合成速率；还可以与血管生长因子（angiogenesis factors）以及成纤维生长因子（b－FGF）紧密结合，抑制血管及新生血管的生成。此外，RI包含7个串联的亮氨酸残基重复片段（leucinrich repeat，LRRs）结构，其合成的蛋白质更展示了丰富的功能，如参与调节细胞周期、细胞黏附、RNA剪切、信号传导以及抑制酶活性等。RI定位于11号染色体的短臂末端（11p15．5），与ras和胰岛素生长因子（IGF－2）基因邻近，此部位与生长调控和肿瘤的发生密切相关。因此，作者推测RI基因可能还存在尚未发现的生物学功能。作者前期研究证实，RI在多种肿瘤细胞中表达下调，如人胃癌细胞系（bgc－823）、人前列腺癌细胞系（DU－145）和人乳腺癌细胞系（MCF－7）等，采用甲基化抑制剂处理后RI的表达恢复［6］；新近实验研究显示［7－8］，RI不仅可在体外抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移、改变细胞黏附、调节细胞周期、诱导细胞凋亡以及抑制血管生成外，还可在体内显著抑制小鼠黑色素瘤的生长和转移。然而，这些研究未能全面阐明RI的功能及其抑癌的分子机制。RI的表达水平与裸鼠移植瘤的生长、侵袭转移以及EMT发生的关系尚不清楚。为了进一步了解RI的功能以及探讨RI与肿瘤发生、侵袭、转移的关系，本文通过研究过表达RI对裸鼠移植瘤生长、侵袭、转移及EMT发生的影响，为探讨其相关分子机制提供理论基础。

本研究结果显示，过表达的RI显著抑制了膀胱癌移植瘤的生长，与其他两对照组比较，有较低的瘤重，更长的成瘤潜伏期及其抑瘤率分别为26．67%和38．85%。肿瘤的生长转移与微血管的生成密切相关，CD31是血小板内皮细胞黏附分子1，与血管内皮细胞特异性结合，参与肿瘤细胞生长、侵袭与转移，是临床广泛应用的血管标记物［9］。为进一步分析RI对膀胱癌移植瘤血管生成的影响，本实验通过检测肺部转移情况，微血管计数以及CD31血管内皮细胞标志物的表达，结果显示，T24－RI组肺组织未见明显转移灶，而两对照组在血管周围均可见细胞核增大、核染色加深且核质比例失调的细胞团，表明已发生肺部转移；裸鼠瘤组织HE染色及组织免疫荧光染色结果也证实T24－RI组较对照组，有更低的肿瘤微血管密度。因此，RI基因的表达可能与膀胱癌移植瘤的生长和转移有关，RI具有明显抗肿瘤效应可能与其抑制血管生成作用相关。

本研究初步探讨上调的RI对膀胱癌移植瘤侵袭、转移及EMT的作用机制，研究结果发现，RI上调可抑制转移相关蛋白的表达，如MMP－2、MMP－9是降解Ⅳ型胶原纤维最重要的酶，高表达时会促进细胞外基质降解，导致肿瘤发生侵袭和转移［7］。Gao等［10］研究显示，异常表达的 MMP－2、MMP－9与非浸润性膀胱癌BIU－87转移密切相关。本研究发现，RI上调降低了MMP－2、MMP－9的表达，阻止细胞外基质的降解，从而抑制了膀胱癌T24细胞侵袭转移的潜能。EMT是上皮细胞与细胞外基质相互作用中失去细胞极性获得迁移与侵袭的能力，并具有间质化细胞特性的生物学过程。EMT的发生与上皮细胞标记物的减少和间质化标记物的增加密切相关。E－cadherin是一种钙依赖性跨膜蛋白，广泛参与同型细胞间的黏附，细胞骨架的稳定，它的异常表达被认为与EMT的发生密切相关［11］。N－cadherin是钙黏附素家族中的神经钙黏蛋白，其异常表达与肿瘤的侵袭与转移密切相关［12］。Le等［13］研究报道，如在乳腺癌患者中E－cadherin蛋白表达明显降低，而Vimentin表达增高，表明乳腺癌患者中也存在向EMT转化的现象。而本实验免疫组织化学染色结果显示，T24－RI组与两对照组比较，上皮细胞标志物E－cadherin表达显著升高，而间质化标志物Vimentin和N－cadherin表达明显降低。结果提示，RI基因可能通过调节EMT关键蛋白的表达水平，增加了细胞之间的黏附力，阻止肿瘤细胞向远处转移，从而降低了移植瘤侵袭和转移的能力。此外，研究表明，肿瘤的发生与一系列转录因子调节密切相关，转录因子可能直接或间接识别其基因序列（E－bax）并结合抑制转录和表达，从而导致上皮细胞向间质化转化的发 生［14］。Fendrich 等［15］已 发 现 转 录 因 子 （Slug、ZEB1、Twist及E12／E47等）的异常表达可以促使肿瘤细胞向EMT转化的发生，使肿瘤细胞获得运动、迁移的能力以及肿瘤细胞之间黏附力降低，为恶性肿瘤发展与恶化提供重要的条件。本研究结果证实，过表达的RI通过降低相关转录因子（Snail、Slug、Twist）蛋白表达的表达，阻止上皮细胞向间质化转变，显著抑制裸鼠移植瘤的生长与转移，从而抑制肿瘤转移的潜能。

综上所述，RI基因与细胞的增殖、黏附、迁移、转移、侵袭的能力以及EMT的发生密切相关，高表达的RI能显著抑制膀胱癌移植瘤侵袭转移的能力。这些发现能为进一步探讨RI的功能及机制提供理论依据，同时也可能作为治疗肿瘤新的靶点。

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［14］潘湘阳．核糖核酸酶抑制因子过表达对黑色素瘤细胞生长、凋亡、侵袭和转移的影响及分子机制研究［D］．重庆：重庆医科大学学位论文，2012．

［15］Fendrich V，Maschuw K，Waldmann J，et al．Epithelialmesenchymal transition is a critical step in tumorgenesis of pancreatic neuroendocrine tumors［J］．Cancers （Basel），2012，4（1）：281－294．