DHA对IFN－γ诱导的3T3L1脂肪细胞MHCⅡ及炎症分子表达的影响

喻日成，罗建华，范元硕，刘 波

（贵州省人民医院内分泌科，贵阳550000）

肥胖已成为流行的健康问题，与代谢性疾病，例如胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、非酒精性脂肪肝以及多囊卵巢综合征紧密相关［1］。肥胖相关的胰岛素抵抗的分子机制目前还不清楚，但是，最近的研究已经表明，低度慢性炎症是发病的重要因素［2－3］。脂肪细胞产生的脂肪细胞因子启动氧化应激和脂肪组织炎症反应，分泌促炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、白细胞介素－6（IL－6）、白细胞介素－1β（IL－1β）、单核细胞趋化因子（MCP－1），导致胰岛素抵抗。MHCⅡ相关基因在脂肪细胞的炎症反应中起重要作用。有研究表明在高脂喂养2周的小鼠脂肪细胞中MHCⅡ相关基因的表达上调，并且与脂肪细胞中的T细胞促炎因子增加及抗炎因子减少相平行［4］。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）有抗炎作用，但目前其作用机制不清楚，有研究表明DHA可以通过抑制TLR2／3／4和TNF－α而产生抗炎作用［5］。本研究主要是探讨DHA对IFN－γ诱导的3T3L1脂肪细胞MHCⅡ及炎症分子 MCP－1、IL－6、iNOS表达的影响，进而从某方面阐明 DHA的抗炎机制。

1 材料与方法

1．1 主要试剂 3T3L1脂肪细胞（ATCC）；低糖DMEM培养基：Giboco；胎牛血清：Giboco；RNA提取试剂盒：QIAGEN；逆转录 试 剂 盒：Applied Biosystems；LightCycler®TaqMan®Master：Roche；MCP－1、IL－6、β－actin一抗：BD Biosciences；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗：Santa Cruz。

1．2 3T3L1脂肪细胞分化 10%小牛血清的DMEM高糖培养液37℃、5%CO2培养3T3L1脂肪细胞，待细胞生长至70%左右，胰蛋白酶消化，分别种植在6孔板及24孔板，2d后细胞生长至100%，去除培养液，加入含10%FBS，1μM地塞米松，0．5mM的IBMX，10μg／mL胰岛素的高糖DMEM培养基中分化2d。2d后换成含10%FBS、10μg／L胰岛素的DMEM继续分化。6d后倒置相差显微镜下观察发现细胞含有较多脂滴，油红染色证实细胞分化成熟。

1．3 分化成熟的3T3L1脂肪细胞处理 分化成熟的3T3L1脂肪细胞加入2ng／mL的IFN－γ，1h后加入200μM 的DHA，24孔板细胞4h后吸干培养液，加入RLT及β巯基乙醇裂解细胞，－80℃冻存以备提取RNA。6孔板细胞加入200μM DHA培养过夜，吸干培养液，用冰PBS液洗3次，加入细胞裂解液，提取总蛋白。

1．4 real time－PCR检测MHCⅡ的相关基因及炎症分子mRNA表达

1．4．1 总RNA制备 按QIAGEN试剂盒说明书介绍的方法提取总RNA，采用Nanodrop ND1000测量RNA的浓度。

1．4．2 cDNA合成 按逆转录试剂盒（Biosystems）说明合成cDNA，总反应体系20μL，反应条件：25℃10min，37℃120 min，85℃5min，4℃后取出样品－20℃保存。

1．4．3 PCR扩增 PCR总反应体系为10μL，含cDNA模板2μL，TaqMan®Master 5μL，ddH2O 2．5μL，引物0．5μL。PCR反应条件：50℃2min，95℃10min（1个循环）；95℃5s，65℃ 1min，72 ℃ 20s（45个循环）；72 ℃ 5min（1个循环）。每个real－time PCR重复3次，以36B4为管家基因，目的基因的相对表达量通过公式2－ΔΔCt计算。

1．5 Western blot测量 MCP－1、IL－6、iNOS蛋白的表达水平（1）收集处理的细胞，用冰PBS液洗3次，加入细胞裂解液，提取总蛋白，通过BCA方法测量蛋白浓度。（2）将30μg的蛋白样品加入10%SDS－PAGE点样孔，100v电压电泳1h。（3）电泳完的凝胶转PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭，加 MCP－1、IL－6、iNOS及β－actin一抗4℃过夜，TBST洗3次，加辣根过氧化物酶酶标记的二抗常温下30min，TBST洗3次。（4）化学发光法显影、定影，将胶片进行扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的相对分子质量和净光密度值。

1．6 统计学处理 采用SPSS 11．0统计软件进行分析处理，数据以x±s表示，组间均数的比较采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 DHA对IFN－γ诱导的3T3L1脂肪细胞炎症因子表达的影响 3T3L1脂肪细胞加IFN－γ诱导后IL－6、iNOS、MCP－1表达均明显升高（P＜0．05），表明IFN－γ可诱导脂肪细胞的炎症反应。IFN－γ诱导后加入200μM 的DHA后，IL－6、iNOS表达出现明显的下降（P＜0．05），有而 MCP－1表达虽然有下降，但差异无统计学意义（P＞0．05），见图1～2。这些结果表明DHA对IFN－γ诱导的炎症反应有抑制作用。

图1 DHA对IFN－γ诱导的3T3L1脂肪细胞炎症因子IL－6、iNOS、MCP－1mRNA相对表达量的影响

图2 DHA对IFN－γ诱导的3T3L1脂肪细胞炎症因子IL－6、iNOS、MCP－1蛋白相对表达量的影响

2．2 DHA对IFN－γ诱导的3T3L1脂肪细胞MHCⅡ相关基因表达的影响 3T3L1脂肪细胞加IFN－γ诱导后MHCⅡ相关基因Ciita、H2Ab1表达明显升高（P＜0．01），加入200μM的DHA后，Ciita、H2Ab1的基因表达明显下降（P＜0．05），见图3。IFN－γ可诱导脂肪细胞 MHCⅡ相关基因的表达，而DHA对这种诱导有抑制作用。

图3 DHA对3T3L1脂肪细胞IFN－γ诱导后MHCⅡ相关基因Ciita、H2Ab1表达影响

3 讨 论

脂肪组织不仅是一种储能器官，而且还可以作为一种内分泌器官分泌多种生物活性物质［6－7］。由脂肪组织分泌的细胞因子有促炎和抗炎作用，促炎性因子分泌增加可导致胰岛素抵抗及多种代谢性疾病如糖尿病、冠心病、高血压。Visser等［8］研究表明肥胖患者血液中的炎症标记物CRP明显升高。研究结果表明，分化成熟的3T3L1细胞加入IFN－γ诱导后，炎症分子IL－6、iNOS、MCP－1明显升高。IL－6在脂肪组织中高表达，与肥胖及胰岛素抵抗密切相关，IL－6可通过增加肝细胞SOCS3的表达介导胰岛素抵抗［9］。MCP－1（CCL2）在脂肪炎症及胰岛素抵抗中的作用尚不清楚，Kanda等［10］研究发现在肥胖状态MCP－1与巨噬细胞浸润入脂肪组织，胰岛素抵抗及非酒精性肝硬化有关。MCP－1诱导蛋白导致3T3L1细胞活性氧／氮自由基（ROS／RNS）、内质网应激（ER）及iNOS的增加。

DHA具有抗炎的作用，但其作用机制不清楚。DHA通过抑制多不饱和脂肪酸代谢限速酶基因FADS1，减少非酒精性脂肪肝的炎症、纤维化及氧化应激［11－12］。Oh等［5］研究证实DHA可以通过抑制巨噬细胞的G蛋白耦联受体－120减小炎症及胰岛素抵抗。本研究发现DHA可以抑制IFN－γ诱导的脂肪细胞炎症因子IL－6、iNOS的表达，脂肪细胞炎症因子表达的减少有利于改善外周的胰岛素抵抗。本研究中DHA对脂肪细胞MCP－1的表达无明显影响。亦有研究表明 MCP－1基因缺陷的小鼠中脂肪细胞的炎症反应无明显改变［13］。

IFN－γ诱导脂肪细胞MHCⅡ表达上调，脂肪细胞可作为一种抗原提呈细胞活化T细胞，T细胞活化后可促使巨噬细胞M1化，分泌多种促炎因子，导致胰岛素抵抗［14］。CIITA作为转录激活因子调控 MHCⅡ的表达。Gyllenberg等［14］研究发现与年龄相关的CIITA等位基因频率变化与1型糖尿病相关。本研究表明DHA能降低IFN－γ诱导的MHCⅡ相关基因Ciita、H2Ab1的表达。MHCⅡ相关基因表达的下调可以减少脂肪炎症反应，因此，作者推测DHA是否通过抑制IFN－γ诱导脂肪细胞MHCⅡ表达的下调从而减少脂肪细胞的炎症反应。

DHA具有明显的抗氧化及抗炎作用，它对脂肪细胞的炎症及MHCⅡ相关基因的表达有明显的作用，通过减少脂肪细胞的炎症从而改善胰岛素抵抗，在与肥胖相关的代谢性疾病中有积极的作用，但未来需进一步阐明其作用机制。

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