c－cbl基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞增殖和侵袭的影响＊

付 冲，胡建国

（1．重庆市第五人民医院妇产科 400062；2．重庆医科大学第二附属医院妇产科 400010）

卵巢癌是发病率位居第2位的女性生殖系统恶性肿瘤，其病死率却高居首位。卵巢癌早期诊断非常困难，临床上发现时通常为中晚期。同时，由于卵巢癌的化疗耐药以及复发等因素，导致卵巢癌患者5年生存率较低。近年来，关于卵巢癌的起源产生了很多新的学说，如：肿瘤干细胞学说，卵巢癌二元论学说以及卵巢癌输卵管起源学说等。这些都足以说明卵巢癌发生复杂，早期诊断困难。因此，有必要对卵巢癌进一步研究［1］。c－cbl是CBL（the Casitas B－cell lymphoma）家族的2个重要成员。拥有连接体功能及E3泛素连接酶功能，其在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）下调过程中发挥重要作用。研究发现，c－cbl在胃癌、肺癌、前列腺癌和结肠癌的增殖和迁移中发挥重要作用。但是，目前尚无在卵巢癌中的报道［2－5］。本文拟研究c－cbl蛋白在卵巢癌的表达及其功能。

1 材料与方法

1．1 实验方法

1．1．1 免疫组织化学法 卵巢癌标本组织芯片购买于西安艾丽娜生物科技有限公司。免疫组织化学法步骤按免疫组织化学S－P法试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）说明书操作：载玻片脱蜡、水化，然后在枸橼酸盐缓冲液（pH 6．0；sigma公司）中运用微波炉抗原修复20min，自然冷却至室温。PBS液洗3min×3次，3%H2O2室温孵育15min，PBS液洗3min×3次，5%驴血清（ab7475，Abcam Company）37 ℃水浴30min，兔抗人c－cbl多克隆抗体（1∶100，ab32027，abcam 公司，美国）；4℃过夜，阴性对照用PBS代替一抗。37℃水浴2h，PBS液洗3min×3次，辣根过氧化物酶标记驴抗羊IgG（1∶300，bse－0294D，北京博奥森生物技术有限公司），PBS液洗3min×3次，辣根酶标记链酶卵白素工作液（北京博奥森生物技术有限公司）37℃水浴30min，PBS液洗3min×3次，二氨基联苯胺（DAB）显色。阴性对照用PBS代替一抗。阳性结果判定标准：所有切片的观察经3名病理科医生独立在光学显微镜下完成，每名病理科医生选择22个具有代表性的高倍视野（10×40倍），计数每个标本阳性细胞数的比例。阳性结果标准按照De Falco等［6］描述的方法判定并评分：0分（阳性细胞数小于1%）；1分（阳性细胞数占1%～20%）；2分（阳性细胞数占21%～40%）；3分（阳性细胞数占41%～60%）；4分（阳性细胞数超过61%）。所有值用均值±标准差表示。

1．1．2 荧光定量PCR检测c－cbl mRNA的表达 用Trozel（GIBCO）抽提细胞总 RNA，逆转录，PCR扩增c－cbl，并扩增GAPDH作为内参物，逆转录试剂盒和RNA提取试剂购自广州复能基因有限公司。c－cbl引物以及荧光定量PCR试剂盒购于广州复能基因有限公司。反应条件：预变性95℃10 min，95℃10s，60℃20s，72℃10s，重复40个循环。阴性对照以无RNA酶的水代替cDNA模板，每例样品及对照均设3个平行复孔，取平均值。反应结束后，由软件自动得出荧光反应曲线以及每个标本反应体系的扩增效率（eficiency）及CT值，实验不同时间重复3次。

1．1．3 c－cbl siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成 以0．25%胰蛋白酶消化，用10%胎牛血清的RPMI－1640培养基制成单细胞悬液，接种于6孔培养板，1．0×105细胞／孔，每孔100UL。当细胞达30%～50%融合时用RNAmate转染c－cbl siRNA，终浓度为5nM。转染48h后，提取同一样品总RNA和总蛋白。

1．1．4 EdU检测细胞增殖 EdU购自广州锐博生物科技有限公司。按照He等［7］步骤检测。

1．1．5 细胞侵袭检测 用24孔Boydem趋化小室（8m，Becton Dickinson），按照说明书方法进行。收获处理后72h后的各实验组细胞，用无血清培养液悬浮，将0．2mL细胞悬液（1×10）加入上室，将含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液600 μL加入下室，每组设3个复孔。在37℃、以5%CO2条件下培养24h。取出膜，用棉签去除上室底部未侵袭细胞，甲醇固定，HE染色，光学显微镜下观察侵袭至膜上的细胞，每孔计数5个高倍视野（×100）的细胞数。

1．1．6 P21和P53蛋白检测 裂解组织以每孔25μg上样，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，依次加入兔抗人P21和P53多克隆抗体（稀释度1∶500），和辣根过氧化酶物标记驴抗羊IgG，化学荧光发光法（ECL）显影（碧云天公司），操作过程按说明书进行。用凝胶成像系统成像，对结果进行灰度扫描分析，相对表达量以P21和P53灰度面积积分分别与内参的比值计算。

1．2 统计学处理 采用SPSS 17．0软件进行统计学分析，实验数据为正态分布，所有数据方差具有齐同性，两组数据的比较采用独立样本t检验进行比较分析，3个或者3组以上的采用one－way ANOVA分析，c－cbl和卵巢癌组织病理关系采用Mann－Whitney U检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 免疫组织化学法染色结果 c－cbl蛋白在卵巢癌组织腺癌、透明细胞癌、内胚窦癌、颗粒细胞瘤、无性细胞瘤、卵泡膜瘤、转移癌均呈阳性表达。在正常卵巢组织呈弱阳性或者不表达。c－cbl在卵巢上皮性癌组织表达评分和正常卵巢组织比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。c－cbl在晚期卵巢癌（Ⅲ／Ⅳ期）组织中表达比早期卵巢癌组织（Ⅰ／Ⅱ期）明显增高。c－cbl在不同年龄患者的卵巢癌组织的表达水平比较差异无统计学意义（P＞0．05），见图1。

图1 免疫组织化学法检测c－cbl在卵巢癌组织的表达水平（×20）

2．2 荧光定量PCR结果 卵巢癌SKOV3细胞中，沉默c－cbl后，与对照组比较，c－cbl mRNA水平明显下调（图2）。

图2 c－cbl siRNA转染SKOV3细胞48h后，c－cbl mRNA和蛋白表达降低

2．3 Western blot检测c－cbl、P21和 P53蛋白水平的表达情况 卵巢癌SKOV3细胞转染c－cbl siRNA 48h后，Western blot结果显示：与对照组比较，c－cbl蛋白水平下调，P21和P53蛋白水平上调（P＜0．05），见图3。

2．4 沉默c－cbl后，卵巢癌SKOV3细胞增殖能力降低 转染c－cbl siRNA 48h后，采用EdU标记卵巢癌SKOV3细胞的增殖能力。EdU浓度为10uM，加入卵巢癌SKOV3细胞中标记4h。后续检测步骤参照Salic等［8］。作者发现，卵巢癌SKOV3细胞中c－cbl基因沉默48h后，与对照组比较，细胞增殖率降低，差异有统计学意义（P＜0．05），见图4。

2．5 卵巢癌SKOV3细胞沉默 c－cbl基因48h后，Transwell小室检测卵巢癌细胞SKOV3侵袭能力，发现沉默c－cbl基因后，卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力明显降低，差异有统计学意义（P＜0．05），见图5。

图3 SKOV3细胞沉默c－cbl后，c－cbl、P53和P21蛋白水平变化

图5 Transwell检测SKOV3细胞c－cbl基因沉默后的侵袭能力

3 讨 论

表皮生长因子受体是erbB家族的成员之一，是一种170×103的膜受体蛋白，具有酪氨酸激酶活性。结合生长因子能够活化细胞内信号转导，促进细胞的增殖，而受体本身则发生内化及下调。c－cbl是CBL家族的重要成员，具有连接功能以及E3泛素连接酶功能，能够靶向以EGFR为代表的一系列具有酪氨酸激酶活性的受体蛋白使之降解。在维持机体稳态中发挥重要作用。

自噬是细胞利用溶酶体消化受损细胞器及大分子物质并为细胞提供能量的过程，被称为“Ⅱ型程序性死亡”，其功能异常与肿瘤的发生、发展密切相关。卵巢癌起病隐匿，预后差，晚期卵巢癌5年生存率仅5%～15%［9］。有研究发现，自噬与卵巢癌的发生、预后及治疗相关［10］。Beclin1等多种自噬相关基因在卵巢癌中表达下调，高表达自噬相关蛋白PEA－15的卵巢癌患者生存期更长，有望成为卵巢癌新的预后指标［11］。有研究发现，CBL拥有一个LIR结构域，这个结构域可以和自噬蛋白LC3相互作用，并且CBL可以作为SRC的受体从而调控自噬［12］。

作者研究发现，c－cbl蛋白主要表达于卵巢癌组织的细胞质。在卵巢癌不同组织来源，包括卵巢腺癌、透明细胞癌、内胚窦癌、颗粒细胞瘤、无性细胞瘤、卵泡膜瘤、转移癌均呈阳性表达。在正常卵巢组织呈弱阳性或者不表达。同时，作者体外实验发现，卵巢癌SKOV3细胞沉默c－cbl基因后，SKOV3细胞侵袭能力和增殖能力均降低，说明c－cbl蛋白在卵巢癌过表达有利于卵巢癌的生长和侵袭。在胃癌当中，c－cbl的高表达与胃癌的侵袭和发展有关，c－cbl有可能成为胃癌新的分子标志物［13］。因此，作者推测，c－cbl蛋白在卵巢癌中高表达和卵巢癌的发生和发展有关，有可能成为一个新的标志物。

P21基因是细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族中的重要成员。一方面，P21与肿瘤抑制作用相关，同时又能通过抑制周期素依赖激酶复合物活性，调整细胞周期、DNA复制与修复之间的关系。进而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程联系起来。P21基因的发现、克隆及其在细胞周期控制与肿瘤发生中有重要作用［14］。近年研究发现，P53是一种肿瘤抑制基因，其基因编码的蛋白质是一种转录因子，控制着细胞周期的启动。和其他肿瘤抑制基因一样，P53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。在细胞周期中，P53的调节功能主要体现在G1和G2／M期校正点的监测，与转录激活作用密切相关。P53基因下游基因P21编码蛋白是一个依赖Cyclin的蛋白激酶抑制剂。P21可与一系列Cyclin－cdk复合物结合，抑制对应的蛋白激酶活性，引起Cyclin－cdk无法磷酸化Rb，非磷酸化状态的Rb保持与E2F的结合，导致E2F这一转录调节因子不能活化，引起G1期阻滞［15］。作者研究发现，卵巢癌SKOV3细胞沉默c－cbl后，P21和P53蛋白表达上调。提示c－cbl调控SKOV3细胞周期和增殖可能通过调控P21和P53蛋白引起。

综上所述，自噬调控基因c－cbl在卵巢癌组织表达增高，沉默c－cbl基因引起卵巢癌增殖能力和侵袭能力降低。c－cbl可能作为卵巢癌治疗的一个靶点或者早期诊断的标志物。后续将继续深入研究c－cbl在卵巢癌中的作用机制。

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