青蒿琥酯对肺腺癌PC9细胞中Axl及其下游信号分子的影响



临床医学研究

青蒿琥酯对肺腺癌PC9细胞中Axl及其下游信号分子的影响

临床医学研究

张钰1，韩静3，周建国1，王菲1，王怡1，马虎1,2，陈正堂3

临床医学研究

(1.遵义医学院附属医院肿瘤医院，贵州 遵义563099；2.贵州省生物治疗人才基地及遵义医学院转化医学研究中心，贵州 遵义563099；3.第三军医大学新桥医院 全军肿瘤研究所，重庆404100)

[摘要]目的 观察青蒿琥酯处理前后人肺腺癌PC9细胞增殖率的变化、对Axl与下游信号分子表达水平的变化及凋亡相关蛋白的影响。方法 用不同终浓度的青蒿琥酯分别处理PC9细胞，24、48、72 h后通过cck-8检测细胞的增殖率。经25 μmol/L及100 μmol/L青蒿琥酯分别处理PC9细胞48 h后用qRT-PCR检测Axl、Akt mRNA的表达水平，用Western blot检测Axl、Akt及凋亡相关蛋白的表达水平。结果 ①青蒿琥酯以剂量和时间依赖性地抑制PC9细胞的增殖，且凋亡相关蛋白caspase-3、PARP表达上调。②用药48 h后可以下调p-Axl、p-Akt的表达。结论 青蒿琥酯能抑制肺腺癌细胞的增殖，导致凋亡相关蛋白表达上调，且能下调Axl及下游信号分子Akt mRNA和蛋白的表达。

[关键词]非小细胞肺癌；青蒿琥酯；增殖；凋亡；Axl

肺癌是死亡率最高的恶性肿瘤，在过去的40年，肺癌的5年生存率并没有得到很大的改善，目前为17%左右[1],其中非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)占到80%左右[2]，而NSCLC中又以肺腺癌最常见，因此对肺腺癌发病机制以及体内各基因的表达情况的研究有助于肺腺癌诊断、治疗和新药的研发。随着医学分子生物学及相关技术的快速发展，人们逐渐找到了与NSCLC有关的关键基因，并开发出针对这些基因及调控靶点的抑制剂，其中靶向表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(ALK)的酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)已经广泛用于NSCLC的治疗中，并取得了显著的疗效。除了EGFR和ALK外，有研究发现在肺腺癌的大多数病例中都存在Axl的激活[3]，其蛋白质和mRNA水平与肺腺癌的不良预后有关[4]。Axl是一种酪氨酸激酶受体，它与配体生长停滞特异性基因6(Gas6)结合后可以导致酪氨酸自身磷酸化并且导致下游分子的磷酸化，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/Ras相关的C3肉毒素底物1(PI3K/Akt/Rac1)是其中的一条下游信号途径，可以促进细胞的增殖，抗凋亡及上皮-间充质转化(EMT)[5]。

研究显示青蒿琥酯(一种青蒿提取物)除了具有传统的抗疟疾作用外，还可以从减缓肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡、阻止血管生成、防止肿瘤组织的侵袭和转移4个方面来发挥其抗癌作用[6]。本课题组前期的研究也发现青蒿琥酯可以抑制肺腺癌A549细胞的增殖及促进其凋亡[7]，但其具体机制仍不是很清楚，因此本文旨在探讨青蒿琥酯发挥抗肿瘤的药理作用与Axl及其下游信号途径的关系。

1材料与方法

1.1细胞和试剂人肺腺癌PC9细胞由第三军医大学新桥医院全军肿瘤研究所陈正堂教授惠赠，培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养；青蒿琥酯购自Sigma Addinich公司；Cell Counting Kit-8(cck-8)试剂盒购自日本同仁公司，Axl、p-Axl、Akt、p-Akt及凋亡相关抗体购自英国abcam公司。

1.2细胞增殖测定实验利用cck-8试剂盒检测青蒿琥酯对肺腺癌PC9细胞增殖能力的影响。将指数生长期的PC9细胞以每孔5×103个细胞的密度，接种于96孔板，每孔100 μL，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，加入青蒿琥酯使其终浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L终体积150 μL，并设置调零孔(无细胞孔)、溶剂组(0.1%DMSO)、空白对照组，每个浓度重复3孔。分别培养24、48、72 h后，弃上清液，每孔加入不含FBS的RPMI-1640培养基，加入10 μL cck8，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养1~4 h后，用酶标仪测波长490 nm处的吸光度(OD)值。

1.3RNA提取和qRT-PCR检测分别收集青蒿琥酯25 μmol/L及100 μmol/L作用48 h及0.1%DMSO对照组的细胞，加入1 mL TRIzol试剂，室温放置5 min，吸取细胞裂解液，加入200 μL氯仿，混匀，12 000 rpm在4 ℃离心15 min；离心后吸取上层液体，加入500 μL异丙醇，混匀，12 000 rpm在4 ℃离心10 min；弃上清，空气干燥，加入适量DEPC水溶解沉淀，即为细胞总RNA；测量RNA浓度，以A(260/280)在1.8~2.0的总RNA为模版进行逆转录；采用SYBR Green PCR Master Mix进行qRT-PCR，使用β-actin作为mRNA定量的内参，对RNA进行定量。mRNA表达水平以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

1.4Western Blot检测细胞内凋亡相关蛋白、Axl及其下游信号分子的表达利用Western Blot实验检测青蒿琥酯对PC9细胞凋亡相关蛋白的影响。实验分为0.1%DMSO对照组，青蒿琥酯25 μmol/L组和青蒿琥酯100 μmol/L组，用青蒿琥酯处理48 h后收集对数生长期的PC9细胞，弃去培养基，冷PBS洗2次，加入混合有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，冰上静置30 min，用细胞刮将细胞轻轻刮至EP管内，4 ℃，12 000 rpm离心20 min，取少量上清BCA法测定蛋白浓度。用裂解液将蛋白调整至相同浓度，1∶4比例加入5x上样缓冲液(碧云天)后，99 ℃金属浴5 min，冷却后上样电泳。凋亡相关蛋白PARP、Cleaved PARP、caspase-3、active capase-3及Axl、p-Axl、Akt、p-Akt用10%的聚丙烯酰胺凝胶分离，采用Bio-Rad湿转系统进行转膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗均以1∶1 000比例稀释，4 ℃孵育过夜。经TBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的特异性二抗以1∶5 000比例稀释，摇床上孵育1 h，最后用ECL化学发光检测，凝胶成像仪扫描。

2结果

2.1青蒿琥酯可以抑制肺腺癌PC9细胞的增殖能力

2.1.1青蒿琥酯对肺腺癌PC9细胞数量和形态学的影响用终浓度为25、50、100 μmol/L的青蒿琥酯作用于PC9细胞，48 h后在光学显微镜下观察到和对照组(0.1%DMSO)相比，各用药组的细胞数量明显减少，细胞形态由短梭形逐渐变成不规则形或三角形，且随着剂量的增加，数量减少得更明显(见图1)。

2.1.2采用cck-8法检测青蒿琥酯对PC9细胞增殖能力的影响用终浓度为6.25、12.5、25、50、100 μmol/L作用于PC9细胞，24、48、72 h后测定490 nm波长的OD值，结果表明，各实验组青蒿琥酯对PC9细胞均有抑制作用，并随药物浓度的增加抑制率显著提高，其48 h的IC50大约为32.14±4.69 μM(见表1及图2)。

A:0.1%DMSO对照; B:青蒿琥酯25 μmol/L组; C:青蒿琥酯50 μmol/L组; D:青蒿琥酯100 μmol/L组。图1　光学显微镜下不同浓度青蒿琥酯处理作用于PC9细胞后的细胞数量及形态的变化(×40)

表1青蒿琥酯对PC9细胞增殖抑制效应(%)

青蒿琥酯浓度(μM)24h48h72h96h6.256.59±5.696.12±6.859.64±13.0911.89±7.5112.59.73±7.4510.01±6.3012.99±12.9719.97±7.732511.91±7.2518.38±7.3718.25±12.5633.4±8.365019.75±12.0645.32±8.9660.52±8.8979.01±3.1310055.37±4.29*87.69±1.93*97.10±0.82*98.71±0.38*#

组内差异 *P<0.05；组间差异 #P<0.05。

图2　青蒿琥酯对PC9细胞的增殖抑制作用

2.2青蒿琥酯可以下调肺腺癌PC9细胞Akt和Axl mRNA的表达分别收集青蒿琥酯25、100 μmol/L作用48 h及0.1%DMSO对照组的细胞，提取总RNA后行Real-time RT-PCR检测，通过ABI系统获得细胞内Axl和Akt基因的相对拷贝数。与对照组比较，青蒿琥酯作用后PC9细胞内Axl和Akt mRNA的表达均较对照组降低，随着青蒿琥酯剂量的增加，其降低更为显著(P<0.01)，说明青蒿琥酯能下调PC9细胞内Axl和Akt mRNA的表达(见图3)。

与对照组比较，*P<0.05;**P<0.01。

图3青蒿琥酯处理48h后PC9细胞中Axl和Akt mRNA的相对表达

2.3青蒿琥酯下调肺腺癌PC9细胞Akt和Axl蛋白及凋亡相关蛋白的表达

2.3.1青蒿琥酯可下调PC9细胞后Axl和Akt的磷酸化水平分别收集青蒿琥酯25、100 μmol/L作用48 h及0.1%DMSO对照组的细胞，提取总蛋白后Western blot检测相关蛋白Axl、p-Axl、Akt、p-Akt表达的变化。可见青蒿琥酯作用48 h后PC9细胞内Axl、Akt、p-Axl、p-Akt蛋白的表达较对照组均有不同程度的降低，且以p-Axl和p-Akt降低更为明显(见图4)。

图4　青蒿琥酯处理48 h后PC9细胞中Axl、Akt及其磷酸化蛋白的表达水平

2.3.2青蒿琥酯可影响PC9细胞凋亡相关蛋白的表达分别收集青蒿琥酯25、100 μmol/L作用48 h及0.1%DMSO对照组的细胞进行Western blot定量检测凋亡相关蛋白的表达。发现青蒿琥酯作用48 h后Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP的表达水平均有不同情况的上调(见图5)。

图5　青蒿琥酯处理48 h后PC9细胞中凋亡相关蛋白的表达水平

3讨论

目前的多项研究显示青蒿琥酯除了抗疟疾作用外，还有广阔的应用前景，其对乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌等均具有细胞毒作用，可以从减缓肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡、阻止血管生成、防止肿瘤组织的侵袭和转移四个方面来发挥抗癌作用[6]。本课题组前期的研究结果表明青蒿琥酯能以浓度和时间依赖性地抑制人肺腺癌A549细胞的生长和增殖，而且能剂量依赖性地诱导细胞凋亡。本研究采用cck8检测不同浓度的青蒿琥酯处理PC9细胞24、48、72 h后也发现青蒿琥酯能够以浓度和时间依赖性地抑制PC9细胞生长和增殖。这表明青蒿琥酯对肺腺癌具有细胞毒作用，其可以减缓肿瘤细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡。

近年来，有不少研究对青蒿琥酯所致凋亡的分子机制进行了探讨，目前的研究已证实青蒿琥酯对PI3K/Akt、NF-κB、MAPK、PKC、STATs等信号通路均有抑制作用，但是具体机制尚不清楚。既往多项研究显示Axl在细胞增殖、迁移、扩散、抗凋亡、EMT等细胞活动中都发挥着重要的作用。Axl是一种原癌基因，位于19号染色体的长臂上，在大约60%的NSCLC细胞系中能观察到Axl的过表达[8]，作为酪氨酸激酶受体，Axl与GAS6结合并且形成二聚体，导致酪氨酸的磷酸化及下游分子的磷酸化，Axl的下游分子有很多，包括PLCγ、MMMP-9、SOCS、PI3K/Akt、ERK1/2、SRC等[9-10]。Sun等发现子宫内膜癌中Axl及Gas6表达明显高于正常子宫内膜，与凋亡细胞比例呈负相关，推测Gas6/Axl信号转导的异常激活与其抑制癌细胞凋亡有关[11]。Sawu等在胃癌MKN7细胞系中发现，Gas6/Axl信号途径能够启动下游PI3K/Akt信号通路，阻止细胞启动程序性死亡程序，抑制胃癌细胞凋亡[12]。

本研究中也发现在PC9细胞中存在Axl及下游信号分子Akt的过表达。因此本研究旨在探讨青蒿琥酯的抗增殖和促凋亡的作用是否与Axl及下游信号分子相关。

首先采用qRT-PCR及Western Blot检测不同浓度的青蒿琥酯处理后PC9细胞48 h中mRNA和蛋白的表达，结果表明，经青蒿琥酯处理后，细胞内Axl和Akt mRNA和蛋白水平均有不同程度的下调，同时其活化形式p-Axl和p-Akt的蛋白表达下调更明显。然后采用Western Blot检测不同浓度的青蒿琥酯处理PC9细胞48h后凋亡相关蛋白Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP的表达情况，结果表明，经青蒿琥酯处理后，细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3、Active caspase-3、PARP、Cleaved PARP均存在不同程度的上调，其中Active caspase-3和Cleaved PARP上调更加明显。我们推测PC9细胞中存在Axl的过表达，Axl的激活能够启动下游的PI3K/Akt信号通路，而青蒿琥酯能够抑制Axl和Akt的活化，促进细胞启动程序性死亡程序，促进肺癌细胞的凋亡。

综上所述，本研究发现，Axl参与了NSCLC的发生发展过程，而青蒿琥酯可以通过抑制Axl及其下游信号通路的活化来发挥抗肿瘤的作用，为青蒿琥酯成为候选抗肿瘤药物提供了又一理论依据。

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[收稿2015-10-16;修回2015-11-12]

(编辑：王福军)

The effects of Artesunate on the expression of Axl and its downstream signal molecules in PC9 lung adenocarcinoma cells

ZhangYu1,HanJing3,ZhouJianguo1,WangFei1,WangYi1,MaHu1,2,ChengZhengtang3

(1.Tumor Hospital of Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China; 2.Biological Treatment Talent Base of Guizhou Province and Translation Medicine Research Center of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099，China;3.Cancer Research Institute, Xinqiao Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 404100,China)

[Abstract]Objective To observe the changes of cell proliferation rate, apoptosis and Axl expression level before and after the treatment of Artesunate in human lung adenocarcinoma PC9 cells.Methods Different concentrations of Artesunate were used to treat PC9 cells. Cell proliferation was analyzed by the cck-8 assay after 24, 48 and 72h. The final concentration of Artesunate treatment PC9 cells were 25, 100 μmol/l, respectively. The mRNA expression levels of Axl and Akt were determined by qRT-PCR; The protein expression levels of Axl、Akt and apoptosis-related proteins by Western blot after 48h.Results (1)Artesunate could inhibit PC9 cell proliferation dependent on the dose and time. The expression of caspase-3 and PARP increased after 48h.(2)The mRNA and protein expression of p-Axl and p-Akt were reduced after 48h.Conclusion Artesunate could inhibit the proliferation of lung adenocarcinoma cancer cells, up-regulate apoptosis-related proteins, and down-regulate the mRNA and protein expression of Axl and Akt, Which are downstream signaling molecules.

[Key words]Non-Small Cell Lung Cancer； Artesunate； proliferation； apoptosis；Axl

[中图法分类号]R734.2

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0610-05

[通信作者]马虎，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：肺癌分子靶向治疗，E-mail:mahuab@163.com。

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：81360351)；贵州省科技厅基金资助项目(NO：黔科合SY字[013]3003)；贵州省高层次创新人才“千”层次人才基地项目。