防龋基因疫苗pVAX1-SPG在BALB/c小鼠免疫部位的原位表达



基础医学研究

防龋基因疫苗pVAX1-SPG在BALB/c小鼠免疫部位的原位表达

孙天瞳1，刘建国1,2，姜晶1，王伟1，亓鹏1，白国辉1,2

(1.遵义医学院口腔学院，贵州 遵义563099；2.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察防龋基因疫苗 pVAX1-SPG免疫BALB/c小鼠后的原位表达。方法 重组质粒pVAX1-SPG经颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠,免疫组化技术观察目的蛋白SpaP-P/GbpA-GBD在免疫部位的表达情况。结果 小鼠双侧颌下腺组织内均可见目的蛋白的弥漫性表达，尤以导管区域表达强烈，导管细胞的胞浆内呈强阳性染色；股四头肌肌纤维胞浆和肌膜下方阳性染色，呈不均匀的受限表达；鼻腔黏膜上皮下方的固有层与结缔组织中可见呈浅棕黄色染色的目的蛋白表达。结论 重组质粒pVAX1-SPG能够在BALB/c小鼠的免疫部位正确表达目的蛋白。

[关键词]基因疫苗；变异链球菌；龋齿；表面蛋白；葡聚糖结合蛋白

龋病是人类最常见的细菌感染性疾病，严重危害着人群的口腔健康。变异链球菌族细菌，主要是变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)和表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)被认为是最重要的致龋菌。其在牙面的黏附、聚集和产酸，是龋病发生的先决条件[1-2]。S.mutans的毒力因子表面蛋白(surface protein antigen，SpaP)在介导S.mutans对牙面的蔗糖非依赖性黏附中起着关键作用，另一毒力因子葡聚糖结合蛋白(glucan binding proteins A ,GbpA)通过与细菌产生的细胞外多糖-葡聚糖结合介导细菌在牙面的黏附和聚集，参与了S.mutans在获得性膜上的蔗糖依赖性粘附。

本课题组前期构建了编码S.mutansSpaP的P区(SpaP-P)和GbpsA功能区葡聚糖结合区(GBD)结构基因的重组真核表达质粒pVAX1-SPG，本研究进一步将该重组质粒经颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠，观察重组蛋白SpaP-P/GbpA-GBD在动物免疫部位的表达，为后续观察该基因疫苗的免疫效果和寻找理想的免疫途径的动物实验研究提供依据。

1材料与方法

1.1主要试剂重组质粒pVAX1-SPG (本课题组前期构建)；真核载体质粒pVAX1(美国Invitogen公司产品)。兔抗SpaP多克隆抗体、兔抗GBD多克隆抗体(本课题组前期制备)，生物素标记的羊抗兔IgG(美国Amresco公司)，质粒纯化试剂盒(美国Omega公司)。

1.2动物分组6周龄雄性BALB/c小鼠18只[购自重庆市腾鑫生物技术有限公司，许可证号：SCXK(渝)20070003]，体重(20±2) g，随机分为6组，每组3只。实验组用pVAX1-SPG免疫，对照组用pVAX1(载体质粒)免疫，均采取颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注3种免疫方式。

1.3动物免疫动物适应性饲养1周后，分别采用双侧颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注方式免疫小鼠1次，质粒剂量为100 μg/只(每侧50 μg)。

1.4标本的采集和处理免疫3 d后断颈处死动物。迅速收集免疫部位的颌下腺和股四头肌以及鼻腔黏膜标本,多聚甲醛固定12~16 h，石蜡包埋，5 μm连续切片。

1.5目的蛋白的原位表达检查采用免疫组织化学染色SP法检测目的蛋白的原位表达。石蜡切片脱蜡后将载玻片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的微波用塑料盒中，微波炉加热后每张切片滴加1滴3%过氧化氢去离子水，室温孵育10 min，每张切片滴加1滴正常非免疫动物血清，室温放置15 min，每张切片滴加(1∶50)的一抗(兔抗SpaP多克隆抗体或兔抗GBD多克隆抗体)50 μL，4 ℃过夜；次日洗片后每张切片滴加1滴生物素标记的第二抗体，室温10 min；洗片后每张切片滴加1滴链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，每张切片滴加30 μL DAB显色，显微镜下控制染色，当组织或目标细胞阳性表达部位为深棕色或棕黄色时终止显色。

2结果

2.1颌下腺区注射pVAX1-SPG免疫后在小鼠两侧颌下腺内均可见目的蛋白呈弥漫性表达，尤以导管区域表达强烈，导管细胞的胞浆内呈强阳性染色(见图1A)，对照组pVAX1免疫后在小鼠两侧颌下腺内均未见目的蛋白表达(见图1B)。

2.2股四头肌注射pVAX1-SPG免疫后在小鼠股四头肌肌纤维胞浆和肌膜下方可见目的蛋白染色阳性，呈不均匀的受限表达(见图1C)，对照组pVAX1免疫后均未见目的蛋白表达(见图1D)。

2.3鼻腔黏膜滴注pVAX1-SPG免疫组在鼻腔黏膜上皮下方的固有层与结缔组织中可见目的蛋白呈浅棕黄色染色(见图1E)，对照组pVAX1免疫后均未见目的蛋白表达(见图1F)。

A:pVAX1-SPG颌下腺区注射组；B:pVAX1颌下腺区注射组；C:pVAX1-SPG股四头肌注射组；D:pVAX1股四头肌注射组；E:pVAX1-SPG鼻腔黏膜滴注组；F:pVAX1鼻腔黏膜滴注组。图1　目的蛋白在免疫部位的表达(SP染色,×400)

3讨论

龋病是人类最常见的口腔感染性疾病，起始于变异链球菌族细菌在牙面的黏附和聚集。表面蛋白(SpaP)、葡萄糖基转移酶(GTF)和葡聚糖结合蛋白(GbpA)是S.mutans的主要黏附因子，也是目前研究较多、生物学功能和分子结构相对明确的毒力因子，被认为是理想的防龋疫苗候选抗原，针对这些毒力因子设计的防龋基因疫苗具有广阔的应用前景[3-4]。

SpaP介导了S.mutans对牙面的非蔗糖依赖性黏附，SpaP的P区(SpaP-P)富含丰富的T、B细胞表位，能够有效的诱发机体的免疫应答[5]。GbpA在S.mutans参与的蔗糖依赖性口腔菌斑生物膜形成中起着关键的作用。研究表明GbpA的葡聚糖结合区(GBD)为介导S.mutans黏附的重要功能区，有较好的免疫原性[6]。由于SpaP和GbpA均参与口腔菌斑生物膜形成，将这两个毒力因子的功能区SpaP-P与GBD的基因共同克隆到同一真核表达载体构建嵌合体防龋疫苗，从理论上讲，将有效阻止S.mutans对牙面的非蔗糖依赖性黏附和S.mutans与其它口腔链球菌的相互黏附(即致龋菌的聚集)，干扰致龋性牙菌斑生物膜的形成，降低龋病的发生率和患龋程度。

用作基因疫苗的真核表达质粒能否有效的诱导机体产生免疫应答，首先要看真核表达质粒能否在机体内正确表达目的蛋白。许多研究已经证明基因疫苗免疫后能够在肌肉和黏膜组织表达重组目的蛋白。Tadokoro 等[7]经鼻接种预防艾滋病基因疫苗后，在局部淋巴结、肝、肺、肾等组织中检测到重组质粒的存在，在肺部检测到特异蛋白。樊明文等[8]通过肌注和颌下腺周注射针对变异链球菌表面蛋白功能区A区和P区的防龋基因疫苗pCIA-P免疫大鼠，观察到重组蛋白PAcA-P能够在免疫部位表达。刘畅等[9]报道针对SpaP和GTF 及免疫佐剂细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4的融合防龋基因疫苗pGJA-P经鼻腔黏膜滴注途径免疫小鼠后在卵巢、肝、胃肠、脾、肾、胸腺、心脏、肺、颌下腺、脑、接种部位组织及其引流淋巴结均检测到重组质粒。免疫第1天在接种部位可观察到阳性表达，而且，第1天的mRNA表达水平高于第3、7天和引流淋巴结。管晓燕等[10]将针对GTF功能区CAT的重组质粒pVAX1-gtf/CAT经水凝胶包裹并以口服等不同免疫途径免疫新西兰大白兔后，在动物的小肠黏膜、鼻腔黏膜、颌下腺和骨骼肌检测到重组蛋白的表达，能够有效的诱导机体的体液和黏膜免疫应答。

课题组前期研制了仅针对SpaP的功能区P区(SpaP-P)或GbpsA功能区GBD的单价防龋基因疫苗，经体外表达实验和免疫小鼠、大鼠和兔等系列研究证实其具有较好的免疫原性，能够诱导机体的体液和黏膜免疫应答，在一定程度上减少大鼠龋齿的发生率[11-14]。在此基础上研制了针对SpaP-P和GBD的双价防龋基因疫苗pVAX1-SPG，希望通过两个抗原的协同效应，进一步增强防龋基因疫苗的免疫原性，提高免疫效果[15]。本研究将该重组质粒经颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注等不同途径免疫BALB/c小鼠，观察重组质粒pVAX1-SPG能否在动物免疫部位表达重组目的蛋白SpaP-P/GbpA-GBD，为后续观察该基因疫苗的免疫效果和寻找理想的免疫途径的动物实验研究提供依据。研究结果显示：重组质粒pVAX1-SPG经股四头肌注射、颌下腺周注射以及鼻腔黏膜滴注三种途径免疫BALB/c小鼠后，均能够在免疫部位表达。目的蛋白在股四头肌肌纤维胞浆和肌膜下方呈不均匀的受限表达，可能是由于肌内膜、肌中膜和肌束膜等肌纤维的物理屏障阻挡了质粒的进入，使肌肉组织最多只有1%~2%的肌纤维细胞被转染，也可能是由于细胞的异质性，不同的细胞表达蛋白的能力不同所致[16]。经颌下腺周注射免疫后，在导管细胞内呈强阳性表达，尤以导管区域表达强烈，这可能与颌下腺周围皮下富含树突状细胞、巨噬细胞等免疫活性细胞有关[17-18]。经鼻腔黏膜滴注免疫后在黏膜上皮下方的固有层与结缔组织中可见目的蛋白的表达，其机制目前还不十分清楚。嵌合目的蛋白在免疫部位组织中的表达，说明质粒被摄取并经转录、翻译等过程正确表达了抗原蛋白分子，为观察该防龋基因疫苗的免疫原性和防龋效果的动物实验，以及寻找有效的免疫途径的研究奠定了基础。

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[收稿2015-10-02;修回2015-11-08]

(编辑：王静)

The expression of anti-caries gene vaccine pVAX1-SPG in BALB/c mice in situ

SunTiantong1,LiuJianguo1,2,JiangJing1,WangWei1,QiPeng1,BaiGuohui1,2

(1. The School of Stomatology, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China；2.The Special Key Laboratory of Oral Diseases Research, Higher Education Institution in Guizhou Province,The Key Laboratory of Oral Diseases Research in Zunyi City, Zunyi Guizhou 563099,China)

[Abstract]Objective To observe the expression of the eukaryotic plasmid pVAX1-SPG as anti-caries gene vaccine, including P domain(SpaP-P) of surface protein antigen (SpaP) and glucan binding domain(GBD) of glucan binding protein A(GbpA)ofstreptococcusmutansin situs.Methods BALB/c mice were immunized with plasmid pVAX1-SPG by three different ways including the intranasal immunization, the quadriceps injection and the submandibular gland-targeted injection.Immunohistochemistry technique was used to detect the expression of recombinant protein SpaP-P/GbpA-GBD.Results The diffused expression of target protein was detected in both sides of submandibular glands,particularly in ducts area with strong positive stain in cytoplasm of duct cells; positive stain in cytoplasm of muscle fiber and under the sarcolemma,but the expression was uneven. The positive light brown stain can be observed in lamina propria and connective tissue of nasal mucosa.Conclusion The fusion protein SpaP-P/GbpA-GBD can be correctly expressedinvivo.

[Key words]gene vaccine；streptococcus mutants；dental caries；surface protein antigen；glucan binding protein A

[中图法分类号]R781.1

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2015)06-0581-03

[通信作者]刘建国，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：龋病的病因与防治，E-mail:liujg_001@163.com。

[基金项目]贵州省优秀青年科技人才培养计划项目(NO：黔科合人字[2005]0509)；贵州省科技创新人才团队建设项目(NO：黔科合人才团队[2013]4026)；省市科技合作专项资金项目(NO：省市科合[2014]41)；贵州省高等学校特色重点实验室建设项目(NO：黔教合KY字[2013]109)。