大庆屠宰牛肉中沙门氏菌的分离鉴定及药敏试验

徐昊，孙海英，翟军军，薛洋洋，徐剑华，任超，穆昱，杨玉英

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

沙门氏菌是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一[1]，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖生产力。沙门氏菌菌型繁多，抗原结构复杂，目前已确认的沙门氏菌有2 535个血清型，中国已检出292个血清型[2]。绝大多数沙门氏菌对人和动物具有致病性，能引起人和动物多种不同的沙门氏菌病，是引起人类食物中毒的常见病原菌。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首[3-4]。近年来，沙门氏菌大规模污染食品并引起食物中毒的事件时有发生[5-6]。动物性食品是沙门氏菌污染的主要对象，动物生前以及后续的屠宰加工、运输、贮藏和销售等环节都容易污染和传播沙门氏菌。此外，沙门氏菌在人和动物中具有广泛的宿主，很容易在动物与动物、动物与人、人与人之间通过直接或间接的途径进行传播[7]。牛肉是我国广大居民的主要动物性食品之一，实时监测牛肉产业链（包括养殖场、屠宰场和销售市场）中沙门氏菌的污染和传播情况对确保牛肉安全具有重要意义。研究旨在了解大庆市部分地区牛源沙门氏菌污染情况，分析其分布与传播，为牛肉生产安全和沙门氏菌食物中毒的预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选择大庆市5个农贸市场即新村区、大同区、红岗区、萨尔图区、龙凤区，于清晨6时采样。购买的牛肉样品立即装入无菌瓶中，再装于无菌的塑料袋密封保存。在塑料袋上做好相应的标记。

1.2 主要培养基

血液培养基，SS培养基，HE培养基。

1.3 主要试剂仪器

沙门氏菌生化鉴定管（批号：071128）和药敏试纸片（批号：20060511），杭州天和微生物试剂有限公司；康为世纪生产的细菌基因组DNA提取试剂盒；高速冷冻离心机，Kendro laboratory公司；DRP-9272型热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；美国Bio-rad C1000 Touch PCR仪，美国Bio-rad公司；标准型双人净化工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂；凝胶成像系统。

2 方法

2.1 细菌的分离培养

将从五个地区采的样品做好记录，把每个肉样的表面和深部组织涂布于血平板上，于温度37℃恒温箱培养16～24 h。

2.2 形态学观察及染色镜检

挑取血平板上培养16 h以上的新鲜菌落，进行形态观察，选取规则的可疑菌落进行革兰氏染色和镜检。镜检后选择可疑菌落进行传代纯培养，接种在SS培养基和HE培养基上。温度37℃恒温箱培养16～24 h，观察SS培养基和HE培养基上菌落形态。

2.3 细菌的生化试验

将需要鉴别的细菌纯培养物接种在乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、苯丙氨酸、丙二酸盐、硫化氢、靛基质、甲基红、枸橼酸盐、尿素等生化试剂管内，于37℃恒温箱培养18～24 h，并设置对照组，相同条件下培养。

2.4 PCR鉴定

2.4.1 细菌DNA的提取

将纯培养的沙门氏菌疑似株接种到5 mL营养肉汤培养基中，37℃震荡过夜。按照康为世纪生产的细菌基因组DNA提取试剂盒的方法，提取细菌的DNA作为PCR反应模板，-20℃保存备用。

2.4.2 引物的设计

根据文献[8-9]针对沙门氏菌invA毒素的基因序列，选择保守性区域用primer 5.0软件设计沙门氏菌invA的特异性引物。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物为5’-CTT TGG TCG TAA AAT AAG GCG-3’；

下游引物为5’-TGC CCA AAG CAG AGA GAT TCT-3’。

2.4.3 PCR扩增

PCR反应体系为25 μL：10×Taq Reaction Buffer（Mg2+Plus）3.0 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.25 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O17.75 μL。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，经30个循环，最后72℃延伸5 min。于4℃保存。

2.4.4 PCR产物的电泳

取PCR产物加在 1%的琼脂糖凝胶（含0.5 μg·mL-1溴化乙锭）上进行电泳，凝胶成像系统观察，拍照留图并分析结果。

2.5 药敏试验

取100 μL沙门氏菌营养肉汤培养液均匀涂布于营养琼脂平板上，再用无菌镊子取各种药敏片轻轻放于表面，37℃培养18～24 h。测量各药敏纸片抑菌圈直径。药敏结果判断按照NCCLS2012年标准，作出判断。

3 结果

3.1 鉴别培养及染色镜检的结果

肉样深部组织涂板未见菌落长出，而表面涂板有菌落生长。在营养琼脂平板上生长2 mm左右的光滑、湿润、半透明、灰白色菌落。SS琼脂上生长带有黑点的小菌落。染色、镜检发现所检测细菌呈革兰氏阴性、两端顿圆的短杆菌。

3.2 生化鉴定结果

琼脂平板分离菌株能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等；不发酵乳糖、蔗糖等；能利用枸橼酸盐；靛基质试验为阴性；硫化氢、苯丙氨酸为阳性（见表1）。

表1 沙门氏菌生化反应鉴定Table 1 Biochemical identification of Salmonella

3.3 PCR鉴定结果

图1为沙门氏菌invA基因的特异性引物进行PCR扩增，从样品中扩增出大小为234 bp目的片段。

3.4 药敏试验结果

沙门氏菌对14种抗微生物药的耐药情况各不相同。对阿米卡星和氯丙嗪的最敏感。而对卡那霉素和依诺沙星也有较高的敏感度。此外，对青霉素G耐药性最高，对万古霉素、四环素和多粘菌素不敏感。各种药物敏感性见表2。

图1 沙门氏菌PCR扩增

表2 沙门氏菌对14种药物的敏感性试验Table 2 Sensitivity test of Salmonella to 14 kinds of drugs

4 讨论

研究检测沙门氏菌采用传统方法分离，PCR鉴定，快速而准确的检测出样品中的沙门氏菌。从采集的31份样品中分离出一株沙门氏菌，检出率为3.2%。沙门氏菌是引起人类食物中毒的常见病原菌，它的研究在兽医与公共卫生上有十分重要的意义。实验中分离得到的沙门氏菌对阿米卡星、卡那霉素和氯丙嗪有较高的敏感性；对多粘菌素和青霉素G耐药性最高；对氨苄西林和红霉素有不同程度的耐药性；对四环素、万古霉素和复方新的明不敏感。由药敏试验结果显示沙门氏菌对抗生素的耐药性已普遍存在，这与抗生素的滥用有直接关系。而牛肉作为我国主要动物性食品之一，在屠宰、运输或销售等环节中都会受到污染。通过对大庆地区牛肉污染情况分析，不仅提高人们对动物性食品安全的关注，还为我们的预防工作提供参考依据。

［1］ 黄福标，卢冰霞，刘磊，等.屠宰猪肠道沙门氏菌的分离鉴定、耐药性分析及致病性试验［J］.中国畜牧兽医，2012，29（1）：172-177.

［2］ 蒋原.食源性病原微生物检测指南［M］.北京：中国标准出版社，2010.

［3］ 魏玲，武会娟，李宝明，等.4种食源性致病菌污染情况及其新型检测技术研究进展［J］.食品科学，2011，32（19）：302-306.

［4］ 侯小刚，刘书亮，韩新锋，等.四川部分地区猪肉产业链中的沙门氏菌的分离及其鉴定［J］.食品科学，2013，34（11）：250-253.

［5］ GB 4789.4-2010.中华人民共和国国家标准-食品微生物学检验沙门氏菌检验［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［6］ 李郁，焦新安，魏建忠，等.屠宰生猪沙门氏菌分离株的血清型和药物感受性分析［J］.中国人兽共患病学报，2008，24（1）：67-70.

［7］ M100-S20.抗微生物药物敏感性试验执行标［S］.宾夕法尼亚：临床和实验室标准协会，2010.

［8］ Rahn K，Grandis D，Clarke R C，et al.Amplification of an invA gene sequence ofSalmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella［J］.Mol Cell Probes，1992（6）：271-279.

［9］ Cohen N D，Neibergs H L，Mcgruder E D，et al.Genusspecific detection of Salmonella using the polymerase chain reaction（PCR）［J］.J Vet Diagn Invest，1993，5（3）：368-371.