微波辅助酶法提取姜黄中姜黄素的工艺研究

宁娜,韩建军,胡宇莉,邹宗尧,郁建生

(1.铜仁职业技术学院 药学院，贵州 铜仁 554300；2.贵州省中兽药工程研究中心，贵州 铜仁 554300；3.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆 401120；4.西南大学 药学院，重庆 400715)



微波辅助酶法提取姜黄中姜黄素的工艺研究

宁娜1,2,韩建军1,2,胡宇莉3,邹宗尧4,郁建生1,2

(1.铜仁职业技术学院 药学院，贵州 铜仁 554300；2.贵州省中兽药工程研究中心，贵州 铜仁 554300；3.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆 401120；4.西南大学 药学院，重庆 400715)

为了研究微波辅助酶法提取姜黄中姜黄素的工艺，以姜黄素收率为考核指标，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对姜黄素提取工艺进行优化。优选姜黄素的最佳酶解辅助提取工艺为：酶用量9.8 mg/g，酶解时间75 min，酶解pH值4.7，酶解温度43 ℃。所建立的提取工艺合理、稳定、可行，为进一步工业化生产提供理论依据。

姜黄；姜黄素；纤维素酶；微波法；提取工艺

姜黄为姜科植物姜黄CurcumalongaL.的干燥根茎，其性温味苦、辛，具有破血行气、散结止痛之功效，主治气滞血瘀、胸腹疼痛、风湿痹痛等症[1]。姜黄含有姜黄素类物质、挥发油、无机元素等成分，其中姜黄素是姜黄药材质量控制的指标成分[1-2]。研究表明姜黄素可提高患子宫内膜炎奶牛的免疫力[3]、提高肉仔鸡的生长性能和免疫功能[4]、提高育肥猪的日增重、降低料重比，同时提高瘦肉率[5]等作用。

已经报道的姜黄提取方法有渗漉法[6]、回流法[6]、超声法[7]、微波法[8]等。其中，微波法是利用微波加热与药材相接触的溶剂，促进目标成分从药材中转移至溶剂中一个过程，具有高效、节能、污染小的特点[9]。生物酶解技术是一种新兴的植物有效成分提取方法，其利用酶反应使植物细胞壁及间质中的组成成分发生降解，从而降低溶剂传质阻力，促进有效成分的释放，具有收率高、反应条件温和且易于控制等特点[10]。基于上述优点，已有学者将微波法和酶解技术联合起来应用于绿原酸[11]、姜辣素[12]、橙皮苷[13]等成分的提取中。目前微波辅助酶法应用于姜黄中姜黄素的提取研究尚未见报道。本文将微波辅助酶法应用于姜黄中姜黄素的提取中，并通过响应面分析法得到微波辅助酶解提取的最佳工艺，为姜黄中姜黄素在兽医临床上的深入开发利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent高效液相色谱仪美国Agilent公司；pHS-3C精密pH计上海雷磁仪器厂；RE-2000A旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；METTLER AE240十万分之一电子天平,德国梅特勒公司；LWMC-201型微波化学反应器,南京旋光科技有限公司。

1.2 药品与试剂 姜黄素对照品,中国食品药品检定研究院，纯度为98.9%；姜黄药材,成都荷花池中药材市场，经本院梁玉勇教授鉴定；纤维素酶,天津利华酶制剂技术有限公司，酶活力为10 000 U/g；水为重蒸水；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 姜黄素含量检测方法

1.3.1.1 色谱条件 参考《中华人民共和国兽药典》[1]，具体色谱条件为：Kromasil-C18柱(4.6 mm×150.0 mm，5 μm)；流动相：乙腈-1%冰醋酸(48∶52)；流速：1.0 mL/min；柱温：28℃；检测波长：430 nm；进样量：10 μL。该色谱条件下理论塔板数以姜黄素峰计算不低于4000。

1.3.1.2 姜黄素的提取 微波辅助酶法提取姜黄中姜黄素的提取工艺流程如下：姜黄→干燥、粉碎成粗粉(过40目筛)→纤维素酶解→微波提取→合并提取液→减压浓缩至100 mL→测定姜黄素含量。通过参考文献[8]及结合预试验结果，确定微波提取姜黄素的工艺条件为：乙醇浓度75%、微波功率390 W、微波时间 60 s、料液比1∶25。

1.3.1.3 姜黄素收率的计算 精密吸取姜黄素浓缩提取液0.5 mL至50 mL容量瓶中，并加甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算姜黄素含量，并计算姜黄素收率，姜黄素收率计算公式为：姜黄素收率(mg/g)=提取液中姜黄素含量(mg)/药材质量(g)。

1.4 单因素试验

1.4.1 酶用量 准确称取10 g姜黄粉末，加入100 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶解时间60 min、酶解pH值 4.5、酶解温度45 ℃的条件下，考察不同酶用量(6、8、10、12、14 mg/g)对姜黄素收率的影响。

1.4.2 酶解时间 准确称取10 g姜黄粉末，加入100 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶用量10 mg/g、酶解pH值 4.5、酶解温度45 ℃的条件下，考察不同酶解时间(20、40、60、80、100 min)对姜黄素收率的影响。

1.4.3 酶解pH值 准确称取10 g姜黄粉末，加入100 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶用量10 mg/g、酶解时间60 min、酶解温度45 ℃的条件下，考察不同酶解pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)对姜黄素收率的影响。

1.4.4 酶解温度 准确称取10 g姜黄粉末，加入100 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液，在酶用量10 mg/g、酶解时间60 min、酶解pH值 4.5的条件下，考察不同酶解温度(35、40、45、50、55 ℃)对姜黄素收率的影响。

1.5 响应面法优化试验 在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以姜黄素收率为考察指标，对酶用量、酶解时间、酶解pH值、酶解温度进行4因素3水平实验设计，对提取条件进行优化，试验因素水平安排见表1。

表1 Box-Behnken设计因素及水平

2 结果与分析

2.1 姜黄素的HPLC测定结果 在1.3.1.1项色谱条件下测定姜黄素标准品及姜黄药材得到的色谱图见图1。峰面积Y与姜黄素浓度X(μg/mL)的回归方程为：Y=139376.81X-28914.74(R2=0.9998)，线性范围为：4.12～41.20 μg/mL。

图1 姜黄素标准品(A)和姜黄药材(B)的高效液相色谱图

2.2 姜黄素提取单因素试验结果

2.2.1 酶用量 不同酶用量对姜黄素收率的影响见图2。结果表明，姜黄素收率随着纤维素酶用量的增加先增大后减小。纤维素酶用量为10 mg/g时，姜黄素收率最大。

图2 酶用量对姜黄素收率的影响

2.2.2 酶解时间 不同酶解时间对姜黄素收率的影响见图3。试验结果表明，姜黄素收率随着酶解时间的延长而升高。当酶解时间超过60 min后，姜黄素收率的增加趋于平缓。

图3 酶解时间对姜黄素收率的影响

2.2.3 酶解pH值 不同酶解pH值对姜黄素收率的影响见图4。试验结果表明，姜黄素收率随着酶解pH值的增大先增大后减小。酶解pH值为4.5时，姜黄素收率最大。

图4 酶解pH值对姜黄素收率的影响

2.2.4 酶解温度 不同酶解温度对姜黄素收率的影响见图5。试验结果表明，姜黄素收率随着酶解温度的升高先增大后减小。酶解温度为45℃时，姜黄素收率最大。

图5 酶解温度对姜黄素收率的影响

2.3 响应面试验优选最佳工艺条件

表2 Box-Behnken试验设计及结果

续表

表3 回归方程的方差分析

2.3.2 响应面分析 响应面图可直观反映各因素之间的交互作用，姜黄素提取工艺参数中酶用量、酶解时间、酶解pH值、酶解温度4个因素之间交互作用对姜黄素收率的影响如图6所示。图6中响应曲面均为开口向下的凸形曲面表明存在考察的范围内响应值(姜黄素收率)的极高值。响应面图的陡峭程度可反映各因素交互作用的强弱及影响程度，响应面图陡峭则表示两因素交互作用影响大。通过分析图6中响应面图可知，酶用量与酶解时间、酶用量与酶解pH值、酶用量与酶解温度、酶解时间与酶解pH值对姜黄素收率影响最大，其次是酶解pH值与酶解温度，而酶解时间与酶解温度对姜黄素提取率影响最小。

图6 两两因素交互作用对姜黄素收率影响的响应面图

2.3.3 最佳工艺条件的确定及验证试验 通过Design-Expert 8.0.6软件分析，得到最佳酶解工艺条件为：酶用量9.80 mg/g、酶解时间75.25 min、酶解pH值4.68、酶解温度42.83 ℃，在此条件下，姜黄素的理论收率为22.10 mg/g。考虑到操作的便利，确定最佳酶解工艺条件为：酶用量9.8 mg/g，酶解时间75 min，酶解pH值4.7，酶解温度43 ℃。在该工艺条件下，对姜黄进行3次平行提取试验，即将姜黄药材按照拟定的酶解工艺条件进行酶解预处理后，再进行微波提取，测得姜黄素收率为21.96 mg/g，RSD=0.47%(n=3)，试验结果与模型预测相对误差仅为0.63%。

3 讨论与小结

姜黄主产于我国四川、云南、广西、广东、福建等地。姜黄的传统提取方法(如渗漉法、回流法、温浸法)存在耗时长、有机溶剂用量大等缺点，本研究基于微波法和酶法在提取中药时的优点，首次将微波辅助酶法应用于中姜黄的提取中，即在常规微波提取的基础上，加入酶解预处理步骤，以期达到高效从姜黄中提取姜黄素的目的。

在单因素试验中，就酶用量而言，随着姜黄素收率随着酶用量的增加而增大，当酶用量达到10 mg/g后，随着酶用量的进一步增加而呈下降趋势，这是由于随着酶用量的增加，促进了酶对姜黄药材植物细胞壁的降解，增加了姜黄素的溶出，当酶用量超过10 mg/g之后，酶与底物的作用点已经达到饱和，继续增加酶用量，使酶过于拥挤而包裹住姜黄药材颗粒，从而阻碍姜黄素的溶出；就酶解时间而言，姜黄素收率随着酶解时间的延长而明显增大，当酶解时间超过60 min后，随着酶解时间的进一步延长而无明显增加；就酶解pH值而言，姜黄素收率随着酶解pH值的增大而增大，当时酶解pH达到4.5后，随着酶解pH值的进一步升高而呈下降趋势，这是由于酶解pH值高于或低于酶的最适pH值均会影响酶的催化活力，从而影响姜黄素收率；就酶解温度而言，姜黄素收率随着酶解温度的升高而增大，当时酶解温度达到45 ℃后，随着酶解温度的进一步升高而呈下降趋势，这是由于酶属于蛋白质，其活性受酶解温度的影响，当酶解温度低于其最适温度时，温度升高可促进其酶活性的增强，而当温度超过其最适温度值时则可引起酶蛋白的变性甚至失活，从而降低酶的催化活力，影响姜黄素收率。

通过响应面试验优选到的姜黄药材最佳酶解工艺为：酶用量9.8 mg/g，酶解时间75 min，酶解pH值4.7，酶解温度43 ℃。姜黄药材在该条件下酶解后，再进行微波提取(乙醇浓度75%、微波功率390 W、微波时间 60 s、料液比1:25)。所建立的提取工艺稳定可行，与单一微波法相比[8]，姜黄素的提取效率有较大提高，与传统提取法(渗漉法、温浸法、回流法)[6]相比，微波辅助酶法提取工艺具有提取效率高、提取时间短、有机溶剂消耗量少等优点，该提取工艺中的试验条件容易控制、溶剂消耗量少、安全环保，为姜黄素的工业化大生产提供参考。

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(编辑：陈希)

Study on Microwave-assisted Enzyme Extraction Process for Curcumin fromCurcumalonga

NING Na1,2,HAN Jian-jun1,2,HU Yu-li3,ZOU Zong-yao4,YU Jian-sheng1,2

(1.DepartmentofPhamrmacy,TongrenVocationalandTechnicalCollege,Tongren,Guizhou554300,China; 2.EngineeringReserchCenterofVetrinaryTraditonalChineseMedicineinGuizhou,Tongren554300,China; 3.AnimalDiseasePreventionandControlCenterofChongqing,Chongqing401120,China; 4.SchoolofPharmaceuticalSciences,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

Curcumin fromCurcumalongawas extracted by microwave-assisted enzyme extraction process.Based on the single factor experiment,the optimal extraction technology was optimized by response surface methodology with curcumin yield as the detective marker.The optimum extraction condition were as follows: cellulase dosage 9.8 mg/g,enzymolysis time 75 min,pH 4.7,enzymolysis temperature 43 ℃.The extraction process is reasonable and scientific,and it could be used in future large-scaled preparation.

Curcumalonga; curcumin; cellulase; microwave; extraction process

贵州省农业类工程技术研究中心项目(黔科合农G字[2015]4001号)

宁娜，博士，副教授。从事药用资源的开发利用工作。E-mail: ningnaok@163.com

2015-11-04

A

1002-1280 (2015) 12-0020-07

S853.73