基于近红外荧光技术快速诊断猪瘟病毒

李伟丰

（河南济源市动物卫生监督所，河南济源 459000）

基于近红外荧光技术快速诊断猪瘟病毒

李伟丰

（河南济源市动物卫生监督所，河南济源 459000）

通过对比猪瘟病毒（CSFV）经典株（shimen）和猪瘟弱毒疫苗株（HCLV）的基因组信息，设计特异的引物和探针，通过扩增获得的核酸产物用于在固定有特异探针的微孔板中进行杂交。杂交结果使用近红外荧光进行扫描检测。利用近红外荧光可以获得高信噪比的检测结果，使用微孔板可以方便地进行多样品同时操作。

猪瘟野毒感染近红外荧光诊断高通量

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起猪的一种以高热稽留、梗死、出血、坏死和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。目前，该病主要在亚洲、欧洲、非洲、美洲的国家与地区流行。在我国，当前各省市均有猪瘟的流行，每年因猪瘟死亡的约占病死猪的l/3以上。我国每年由猪瘟导致的直接经济损失有数10亿元，造成了巨大的资源浪费。

基于我国目前的国情，效仿美欧所采取的扑杀措施在经济上是很难承受的，所以，开发一种能够快速检测猪瘟感染的方法是很有必要的。目前，CSFV诊断的主要方法包括：病原学诊断、血清学检测、间接血凝试验和分子生物学方法，其中，分子生物学方法因为具有高度特异性和灵敏性而受到越来越多的关注。分子生物学诊断的原理主要依靠设计特异的引物，使用PCR或qPCR等方法进行鉴别。

利用荧光技术检测生物大分子在生化分析和研究中应用已经相当广泛。一般的荧光染料激发和检测波长分子位于可见光范围（约400～700 nm）内，机体的内源性物质、杂质等经可见光激发都有很强的自体荧光，易产生高背景荧光干扰检测，所以一般的荧光染料不能直接用于生物检测。近红外光（Near-Infrared，NIR）波长范围在700～900 nm，在这个范围内生物体和生物组织自身吸收散射和自发荧光背景都比较低，检测的信噪比和灵敏度相比可见光谱荧光都有极大的提高。

本文中我们介绍一种利用近红外荧光（NIRF）快速诊断CSF的方法，首先使用常规方法处理病料，提取RNA，反转录后，使用引物进行反向延伸，同时，引入biotin修饰的dUTP，获得的延伸产物与微孔板中固定的探针进行杂交，然后使用修饰有近红外荧光染料的链霉亲和素进行检测。这个方法具有高通量、特异性高，快速等优势，同时可以排除猪瘟弱毒疫苗的干扰。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器

TRIzol试剂购自Invitrogen公司；Taq聚合酶、RNA酶抑制剂、DL2000 DNA Marker等购自大连宝生物工程有限公司；GoldView购于天根生化科技有限公司；反转录酶MLV购于Promega公司，DEPC购于Ameresco公司；琼脂糖为Sigma公司产品；近红外荧光染料购自美国LI-COR公司，其他试剂均为国产分析纯产品。

DNA-BINDTMWhite 96 Well Polystyrene Microplate（Corning，2505），Odyssey双色红外荧光成像系统（美国LI-COR公司），高速冷冻离心机3-30KS（sigma公司），凝胶成像仪（Bio-Rad），恒温金属浴（ependof）。

1.1.2 病料

猪瘟兔化弱毒疫苗有**提供，收集济源市周边不同地区的疑似猪瘟病例10个，送检病料取脾脏、淋巴结或扁桃体。

1.1.3 探针和引物设计

1.2 方法

1.2.1 实验材料准备

在无菌环境中剪去脂肪，肌腱等组织。按照1∶5的比例加入无菌PBS，使用研磨器研磨后放入-20℃冰箱冻存备用。按照说明书使用TRIzol试剂提取备检病料和猪瘟兔化弱毒疫苗的RNA，溶解后测定浓度，取3μg RNA用于反转录合成cDNA，反应体系共计20μl：5xRT buffer 4μl；dNTP（10mmol/μl）2μl；RNAase抑制剂 1μl；Rev-R引物（10pmol/μl）1μl；反转录酶（200U/ μl）1μl；DEPC水 6μl；混合后42℃水浴40min，然后95℃维持5 min。反转录产物作为模板进行PCR，反应体系50μl，其中包括5μl的cDNA产物，其中，按照5000：1加入biotin-dUTP，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 探针设计及固定

根据NCBI网站收录的猪瘟病毒基因组信息，经典株（CSFV）登录号：12657941，兔弱化株（HCLV）登录号：AF531433.1，通过序列比对设计探针和引物。

将合成的5'端NH2修饰的探针粉末溶于寡核苷酸结合缓冲液（OBB，50mM磷酸钠，pH8.5；1mM EDTA，pH 8.0；50mmol磷酸钠配制：1mol Na2HPO4：1M NaH2PO4=43.65：1；），制成100μM的贮存液，使用OBB稀释至0.25 pmol/μl后，以每孔100μl加入微孔板，4℃孵育过夜；使用OBB溶液反复清洗5遍后，以200μl/well加入封闭液（3% BSA），37℃孵育30min。

1.2.3 探针固定效果检测

稀释H-Con和C-Con至浓度为2nm，分别加入固定好探针的孔中，每孔60μl，然后300RPM，50℃混匀，维持1h后，使用马来酸（0.1mol马来酸，0.15molNaCl，pH 7.0）清洗3次；加入提前稀释好的Streptavidin-IRDye800CW（1∶10000），每孔加入80μl后，37℃，1h；使用马来酸清洗3次以上，将微孔板放入Odyssey近红外激光成像系统扫描检测结果。

1.2.4 病料检测

将PCR产物用凝胶回收试剂盒回收目标片段后，测定浓度。稀释为2 nm后，95℃，5 min变性后迅速加入固定有探针的微孔板中，每孔加入60μl，剩余步骤按照前述操作进行。

其中Fix-C用于确定猪瘟病毒是否存在，Fix-H用于当Fix-C为阳性时区分是野毒感染还是疫苗接种。

2 结果与分析

2.1 序列比对结果

根据NCBI收录的猪瘟病毒与兔化弱毒株基因组信息，进行序列比对，发现在3’端有一个9bP的插入突变，[12]利用这个差异设计探针用于区分野毒感染和疫苗接种。比对结果见图1。

图1 CSFV和HCLV基因组序列比对结果（局部）

2.2 PCR结果

使用1%的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR的结果，结果如图2所示，从图中可以看出设计的引物都可以从CSFV和HCLV中扩增出片段，而产物中9个碱基的差异通过凝胶检测是不能发现差别的。

图2 对病料样品和疫苗样品扩增结果（H：HCLV，C：CSFV，1-10：10个待检测病料，N：NC，M是DNA Marker。）

2.3 探针固定结果

将合成的探针利用其上修饰的氨基基团与微孔板上的NOS基团共价连接后固定到微孔板，将互补探针加入微孔板进行杂交，每个探针重复2次。

图3 探针在微孔板固定后的检测（第1列：Fix-C，第2列：Fix-H，第3列：空白对照）

2.4 杂交检测结果

用HCLV和CSFV的PCR结果作为样品用于杂交检测。结果如图4所示。从结果可以看出所设计的探针可以区分HCLV和CSFV。

图4 HCLV和CSFV扩增结果的检测（A、B：Fix-C，C、D：Fix-H，1：CSFV，2：HCLV）

对PCR呈阳性的结果进行探针检测，结果如图5所示。从图中可以看出9个阳性病例均为野毒感染。

图5 送检病料的检测结果（A、B：Fix-C，C、D：Fix-H，1、3-10：阳性样品）

3 分析与讨论

目前猪瘟试验室诊断方法在敏感性、特异性、时效性等方面都存在各自的不足，而且这些方法都不能有效地区分野毒感染与疫苗接种。按照国际通行的做法[1，13]，一旦暴发猪瘟疫情，对涉及的所有猪只一律进行扑杀焚烧处理。依照我国现有国情[14]，这将会导致大量的非野毒感染猪被“错杀”，损害养猪者利益，阻碍养猪业的发展，破坏肉品的稳定供应。

本研究利用猪瘟病毒的经典株和兔化弱毒株在基因组序列上的差异，这些差异可以利用不同的探针进行检测，以区分确诊病例是野毒感染还是疫苗接种。利用微孔板操作可以实现快速、批量的操作，检测通量高。本文中的10个病料样品使用一个微孔板即可完成检测。

[1] 修金生.不同规模猪场种猪猪瘟抗体检测与猪瘟净化[J].福建农业学报，2010，25（2）：235-238.

[2] 周家喜.猪瘟疫苗治疗猪瘟的探讨[J].中国畜禽种业，2007，3（10）：66-67.

[3] 梁淑兰，肖俊婷，刁贺军.非典型猪瘟与隐性感染猪瘟[J].中国兽医杂志，2007，43（7）：81-82.

[4] 陈钟鸣.规模化猪场非典型猪瘟的诊断和防制[J].畜牧与兽医，2007，39（5）：49-51.

[5] 程喜荣.免疫猪群暴发猪瘟的诊断与分析[J].湖北农业科学，2003，（5）：82-83.

[6] 张鹏举.仔猪猪瘟的诊断与防制[J].中国畜牧兽医，2005，32（8）：50-51.

[7] 李菲.猪瘟分子生物学诊断新进展[J].中国畜牧兽医，2010，37（6）：168-170.

[8] 吕红生.猪瘟疫苗注射后发生猪瘟的原因分析[J].云南畜牧兽医，2004，（3）：31.

[9] 傅妮娜，王红，张华山.近红外荧光探针及其在生物分析中的应用进展[J].分析科学学报，2008，24（2）：233-239.

[10] 郑洪，朱昌青，陈小兰.近红外荧光探针法测定核酸的研究[J].福州大学学报（自然科学版），1999，27（Z1）：122.

[11] 胡敏.近红外荧光探针天青A检测DNA[J].分析化学，2007，35（6）：890-892.

[12] 曹晟，张楚瑜，伊光辉.猪瘟病毒的重组分析[J].遗传学报，2005，32（1）：52-56.

[13] 胡薛英.猪瘟免疫猪群暴发猪瘟的诊断[J].华中农业大学学报，2000，19（2）：147-150.

[14] 林荣泉.非洲猪瘟与猪瘟的鉴定及防控技术[J].肉类工业，2001，（3）：25-28.