乳腺癌组织中TET2突变与5hmC表达的关系

顾盼盼　罗欣　张宏伟　谭理　陈浩　孔令春　刁建波　石雨江　马端

(1. 复旦大学生物医学研究院，上海　200032;2. 复旦大学附属中山医院普外科，上海　200032)



·论著·

乳腺癌组织中TET2突变与5hmC表达的关系

顾盼盼1罗欣1张宏伟2谭理1陈浩1孔令春1刁建波1石雨江1马端1

(1. 复旦大学生物医学研究院，上海200032;2. 复旦大学附属中山医院普外科，上海200032)

摘要目的：探讨乳腺癌组织中TET2(ten-eleven translocation 2)基因的突变与5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)表达的关系。方法： 收集100例乳腺癌患者的癌组织标本。用Sanger方法检测乳腺癌组织中的TET2突变情况；用免疫组化方法检测乳腺癌组织中5hmC的表达情况；分析TET2突变与5hmC表达的关系。结果：100例乳腺癌组织中有13 种TET2 突变，在4例患者的肿瘤组织中发现3种以前未报道过的TET2突变 (Ala341Val、Leu1622Phe、Pro1578Tyr)， 在2例患者的肿瘤组织中均检测到Pro1578Tyr突变。免疫组化结果显示，有TET2突变的乳腺癌组织中的5hmC表达明显低于无TET2突变的乳腺癌组织。结论：乳腺癌中TET2突变导致5hmC水平下降。

关键词TET2；乳腺癌；5-羟甲基胞嘧啶；突变

基本项目：国家重点基础研究发展计划”(编号：2009CB825602；2009CB825603)

近30年来，我国城市居民乳腺癌的发病率显著上升，已经成为严重的公共健康问题[1]。因此，研究乳腺癌的发病机制具有重要意义。TET2( ten-eleven translocation 2)是一种α-酮戊二酸(α-KG)依赖性 DNA 羟化酶，能催化5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。研究[2]表明，TET2导致酶活性降低的突变很可能与癌症的发生相关。TET2基因定位于染色体4q24，有11个外显子，骨髓恶性肿瘤患者在该区域表现出复杂性微缺失和拷贝数平衡的杂合性缺失(CN-LOH)[3]。在白血病患者中，TET2突变常伴5hmC表达水平锐减。近年来的研究显示，乳腺癌患者的组织干细胞/祖细胞5hmC总含量显著降低[4]。本研究拟通过检测乳腺癌组织中TET2的突变情况以及5hmC的表达水平，探讨两者的关系。

1资料与方法

1.1一般资料收集2008—2010年在复旦大学附属中山医院普外科行乳腺癌根治术的100例乳腺癌患者的肿瘤标本。所有患者术前均未接受放疗、化疗；乳腺癌标本均在手术切除后15 min内采集。另收集100例在复旦大学附属中山医院体检中心体检的健康人的外周血淋巴细胞。本研究经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准。

1.2试剂DNA提取试剂盒、DNA PCR扩增试剂盒购自美国Omega生物技术公司；鼠抗人5-hmC单克隆抗体购自美国BD公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、免疫组织化学SP试剂盒及二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)试剂盒购自上海长岛生物技术公司。

1.3基因组DNA的提取、TET2外显子的PCR扩增和TET2 测序基因组DNA的提取按照DNA提取试剂盒说明书进行。设计针对人TET2前9个外显子区域(第10个和第11个外显子不编码氨基酸)的25对引物(引物序列见表1)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。对基因组DNA的PCR扩增参照DNA PCR扩增试剂盒说明书。PCR产物由上海生工生物工程股份有限公司采用Sanger方法测序。

表1　针对TET2前9个外显子区域设计的25对引物的序列

1.4免疫组化染色按照免疫组织化学SP试剂盒说明书进行。细胞核见棕褐色颗粒为5-hmC表达阳性，细胞核无棕褐色颗粒为阴性。

2结果

2.1乳腺癌组织中的TET2突变用25对TET2引物、以100例乳腺癌组织的基因组DNA为模板，成功完成2500个PCR反应。采用Sanger法对PCR产物进行测序，共发现13种TET2突变；通过将测序结果与健康人外周血DNA比较并比对数据库Genebank后发现3种新的TET2突变，分别为Ala341Val、Pro1578Tyr和Leu1622Phe；见表2。在2例患者的乳腺癌组织中均检测到Pro1578Tyr突变。Pro1578Tyr和Leu1622Phe突变位于第9个外显子，并且与TET2催化结构域相对应(图1A)。Ala341Val突变发生在第1个外显子，在TET2的N端(图1A)。根据详细的碱基变化推断，3种新发现的突变均为杂合突变(图1B)。

表2　乳腺癌组织中TET2的突变情况

A： 3种突变在TET2上的位置模式图； B： 测序图谱显示TET2中突变点的碱基变化

图1乳腺癌组织中的3种TET2突变：

Ala341Val、Pro1578Tyr和Leu1622Phe

2.2乳腺癌组织中的TET2突变与5hmC水平 根据测序结果随机抽取无TET2突变的乳腺癌组织及有TET2突变的乳腺癌组织，通过免疫组化染色观察5hmC的表达情况。结果发现，TET2无突变的乳腺癌细胞(图2N、2W)的细胞核呈5hmC阳性表达。TET2突变的乳腺癌组织中5hmC呈阴性表达(图2M1、M2)，且在肿瘤细胞旁有较多的淋巴细胞浸润(箭头所示)。

N、W： 野生型TET2乳腺癌组织中的5hmC表达；M1： TET2 突变(Leu1622Phe)乳腺癌组织中的5hmC表达；M2： TET2 突变(Ala341Val)乳腺癌组织中的5hmC表达。箭头示肿瘤细胞周围的大量炎性细胞

图25hmC在乳腺癌组织中的表达

3讨论

近年来，TET2突变在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到关注。研究[5-9]表明，骨髓增生性肿瘤(MPN)、骨髓增生性疾病(MPD)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)中均存在不同形式和比例的TET2突变。

目前，尚无关于乳腺癌中TET2突变的报道。本研究针对人TET2前9个外显子区域设计25对引物、以100例乳腺癌组织的基因组DNA为模板进行PCR，发现13种TET2突变，其中3种突变(Pro1578Tyr、Leu1622Phe 和 Ala341Val)为首次发现。Pro1578Tyr和Leu1622Phe位于TET2基因的第9个外显子，与TET2的催化结构域相对应，提示这两种突变可能导致TET2酶活性的改变。鉴于3种新发现的突变均为杂合突变，我们认为这些突变为体细胞突变，而非种系突变，由此推断TET2突变可能在乳腺癌发病中起了重要作用。

TET2蛋白质催化产生的主要氧化产物——5hmC，是一种重要的表观遗传修饰产物。研究发现，5hmC的缺失与癌症的发生发展密切相关， 5hmC在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌中的水平均显著低于相应的癌旁组织[10]。TET2蛋白质具有独特的富含半胱氨酸(cys-rich)的区域和双链β螺旋结构域(DSBH区域)，这些区域中有负责双加氧酶活性的催化结构域(图1B)。有趣的是，我们发现的3种新突变中，Pro1578Tyr和Leu1622Phe突变均位于TET2的催化域中(图1B)。我们进一步用免疫组化方法证实了在野生型TET2的乳腺癌组织中5hmC均呈阳性表达，而TET2突变的乳腺癌组织中5hmC表达显著下降。以上结果提示，TET2突变导致乳腺癌中5hmC水平下降。值得注意的是，TET2突变(Ala341Val)位于TET2催化域外，但发生该种突变的乳腺癌组织也呈5hmC阴性表达。其机制可能为：TET2的N末端突变影响其与辅助因子的结合，从而影响TET2与正确的DNA区域结合；换言之，如果没有上述辅助因子的帮助，TET2将不能在体内结合正确的DNA区域，从而导致乳腺癌组织中羟甲基修饰水平降低。我们在研究中也发现，TET2突变的乳腺癌组织中，肿瘤细胞周围有大量的炎性细胞渗出，尚不知这是否是普遍的现象，有待在更大样本中验证。

综上所述，本研究对100例乳腺癌患者的癌组织进行了TET2突变的研究，共发现3种新的TET2突变类型，并发现这些TET2突变的乳腺癌组织中5hmC表达水平下降，TET2表达的异常调控或TET2酶活性改变可能是乳腺癌细胞DNA低羟甲基化的原因。这些研究结果为乳腺癌发生和发展调控机制的研究提供了新的视角。

参考文献

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Relationship between TET2 Mutations and Expression of 5hmC in Breast Cancer Tissues

GUPanpan1LUOXin1ZHANGHongwei2TANLi1CHENHao1KONGLingchun1DIAOJianbo1SHIYujiang1MADuan11.InstitutesofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To explore the relationship between ten-eleven translocation 2 (TET2) Mutations and Expression of 5hmC in breast cancer. Methods: TET2 mutations in breast cancer tissues from 100 patients were detected by Sanger method. The expression of 5hmC in breast cancer tissues was detected by immunohistochemistry. The relationship between TET2 mutations and expression of 5hmC was analyzed. Results: A total of 13 kinds of TET2 mutations were identified in 100 patients. Among them, 3 new types of mutations were identified in 4 patients. They were Ala341Val, Leu1622Phe and Pro1578Tyr. Pro1578Tyr was identified in two patients. And immunohistochemical analysis showed that there was a sharp reduction of 5hmC in breast cancer tissues with TET2 mutations than in breast cancer tissues without TET2 mutations. Conclusions: TET2 mutations can lead to decrease of 5hmC level in breast cancer.

Key WordsTen-eleven translocation 2； Breast cancer；5hmC；Mutations

通讯作者马端，E-mail：duanma@fudan.edu.cn

中图分类号R737.9

文献标识码A