火鸡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

刘杉杉，孙 伟，闫敏鑫，黄秀芬，姜 良，何 诚，李永清*

(1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，畜禽疾病防控技术北京市重点实验室，北京 100097；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

火鸡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

刘杉杉1,2，孙 伟1，闫敏鑫1，黄秀芬1，姜 良1，何 诚2，李永清1*

(1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，畜禽疾病防控技术北京市重点实验室，北京 100097；2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

针对火鸡疱疹病毒(HVT)特异性的sorf1区基因序列设计引物，建立检测HVT的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明，建立的实时荧光定量 PCR方法标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r2=0.99)，熔解曲线分析显示该PCR扩增具有良好的特异性、敏感性和重复性，试验表明该方法最低检测浓度为7×101拷贝/μL。利用该方法对野生型HVT和rHVT-pmpD-N在体内和体外的复制特性进行检测，结果表明重组后的HVT与野生型HVT的增殖速度基本一致。本试验建立的检测方法能够快速检测HVT，准确率高，特异性好，具有较高的灵敏度和稳定性，为监测HVT体内和体外的病毒含量和复制情况提供了一种有效的手段。

火鸡疱疹病毒；SYBR Green Ⅰ；实时荧光定量PCR；sorf1

马立克病(Marek' disease, MD)是一种由马立克病病毒(Marek' disease virus, MDV)引起的鸡淋巴组织增生性传染病[1]。根据血清学特性将MDV分为3个血清型，Ⅰ型为具有致瘤性的MDV，Ⅱ型为天然无致瘤MDV，Ⅲ型为火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey, HVT)。鸡是MDV最重要的天然宿主，商品化鸡群感染以T细胞淋巴瘤和严重的免疫抑制为特点。20世纪70年代，从家养火鸡中分离到一种自然发生的非致病性的MDV毒株即HVT，并用作疫苗来预防MDV感染，取得了良好效果。此后，HVT疫苗及以HVT为载体的多价疫苗得了到广泛使用和研究[2-7]。这些疫苗在一定程度上可以有效地控制MD的流行，阻止临床症状的发展，抑制肿瘤的形成，并可以减少淋巴器官中病毒粒子的数量，但不能抑制MDV的感染及其在鸡体内的复制[8]。

HVT能够导致鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast，CEF)发生病变，体外通常采用蚀斑技术对HVT疫苗免疫效力和增殖情况进行检测[9]，但该方法准确性低，重复性差，易受许多因素的影响，如鸡胚、外界病原、pH、琼脂覆盖量和病毒稀释液等，而且试验操作繁琐、周期性长，很难应用于大量样品的检测。HVT的体内定量检测主要是通过实时荧光定量PCR检测方法[10]，Susan等建立的探针法荧光定量PCR方法省时省力，可以实现快速检测的目的，但是探针的合成比较昂贵，设计难度大。

HVT基因组为双链DNA，基因组结构与其他α疱疹病毒类似，由一个长独特区(UL)及其两侧的末端长重复序列(TRL)/内部重复序列(IRL)，和一个短独特区(US)及其两测的末端短重复序列(TRS)/内部短重复序列(IRS)所组成。HVT与MDV-1都包含有76个基因同源物，大部分位于UL和US区，其中sorf1基因为HVT所特有，可用于对HVT进行检测。

目前，尚缺乏一种快速、简捷检测HVT疫苗中活病毒的含量，并可准确定量其增殖情况的方法[11]。本试验通过构建HVT的重组质粒标准品，利用SYBR Green Ⅰ特异性结合到DNA分子上的特性，建立一种实时荧光定量 PCR检测方法，为检测体内外HVT的病毒含量和增殖提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 HVT-BAC细胞毒，即将HVT的完整基因组构建在BAC载体上，由英国动物健康研究所Venugopal Nair教授赠送；rHVT-pmpD-N细胞毒，是将鹦鹉热衣原体CB7的pmpD-N基因插入HVT-BAC中获得的重组毒，由本实验室构建。

1.1.2 主要试剂 pMD○R18-T Simple载体为TaKaRa公司产品；ExTaqDNA聚合酶为宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA提取试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒为Qiagen公司产品；iTaqTMUniversal SYBR○RGreen Supermix试剂盒为Bio-Rad公司产品。

1.1.3 主要仪器和设备 PCR仪(MT Mini)、数码凝胶图像处理仪为Bio-Rad公司产品；超纯水系统(Milli-Q Integral)为Millipore公司产品；微量紫外分光光度计(Nanodrop 2000)为Gene公司产品；Bio-Rad iQ 5荧光定量PCR仪为Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR引物的设计 根据GenBank登录的HVT FC126毒株(AF282130)的sorf1区序列，应用Primer 5.0和DNAStar设计引物。引物如下：sorf1 F(上游引物)：5′-AGTCTCGAGCGTGGACAGAT-3′；sorf1 R(下游引物)：5′-CCAAACGTCCGTAGACGAAT-3′。预期扩增片段为175 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2 标准品的制备及鉴定 从HVT-BAC细胞毒中提取DNA，具体操作过程参照Qiagen公司DNA提取试剂盒步骤进行。以提取的HVT-BAC基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25 μL：ddH2O 15 μL，10×ExTaqbuffer 2.5 μL，dNTP 3 μL，上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物 (10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，ExTaqDNA polymerase 0.5 μL。反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 10 s，进行30个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃结束反应。

扩增结束后，取5 μL扩增产物与1 μL 6×DNA Loading buffer混合，加入20 g/L琼脂糖凝胶孔中，同时加入DNA Ladder 2000作为Marker，紫外分析仪进行观察。

将扩增出的PCR产物进行胶回收后与pMD○R18-T Simple载体进行连接，转化TOP10感受态细胞。PCR鉴定为阳性的单菌落送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并采用DNA Star软件将测序结果与目的序列进行比对。

将测序正确的菌液，小量提取质粒。将提取后的含有sorf1基因的重组质粒命名为p-sorf1。紫外分光光度计Nanodrop 2000测定质粒的浓度和纯度，并参考以下公式计算基因的拷贝数：单位体积质粒拷贝数(拷贝/μL)=6.02×1023(ng/μL×10-9)/碱基数×660。将已经计算好拷贝数的阳性质粒p-sorf1做梯度稀释，即浓度分别为：7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101拷贝/μL，作为标准品。

1.2.3 优化反应体系 在同一浓度模板的反应体系中，采用正交试验法分别对引物浓度和退火温度进行优化。

1.2.4 制作标准曲线 以上述10倍梯度稀释的重组质粒标准品作为模板，利用优化的反应条件，进行real-time PCR扩增，并进行标准曲线的绘制。

1.2.5 敏感性试验 将重组质粒10倍梯度稀释，分别以7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、7×100拷贝/μL为模板，利用优化的反应条件进行荧光定量，以检测结果阳性的最高稀释度的质粒浓度作为检测下限。

1.2.6 重复性试验 将重组质粒分别做3次稀释，选取7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101拷贝/μL重组质粒作为模板，进行重复性试验，并对各个浓度标准品的阈值(Ct值)进行统计学分析。

1.2.7 试验样本检测 将构建好的rHVT-pmpD-N和野生型HVT以400 PFU同时分别接种CEF细胞，收集感染后12、24、48、72、96、120 h的细胞。提取DNA，并进行含量测定。测定后将含量统一稀释到1 ng/μL，对不同时间段的病毒含量进行检测。同时将收集的不同时间的细胞进行蚀斑检测。

将35只1日龄SPF鸡随机分成3组，对照组10只，以1.3×105/只剂量背部皮下接种CEF细胞。试验组一10只，相同部位按照剂量为8 000 PFU/只接种野生型HVT。试验组二15只，同一部位以8 000 PFU/只剂量接种rHVT-pmpD-N。所有鸡只，每周采用肝素钠抗凝采血，每只鸡1 mL，共采集5次，分别进行淋巴细胞的分离。试剂盒提取DNA后，经含量测定后，均稀释到到15 ng/μL，利用建立的方法对不同时间段的病毒含量进行检测。

为了证实该方法的特异性，本试验采用Qiagen公司DNA提取试剂盒，从MDV CVI988/Rispens病毒株及其细菌人工染色体感染的细胞中提取DNA，利用此方法对提取的DNA进行检测。

2 结果

2.1 标准品的制备及鉴定

普通PCR反应体系扩增后，经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测发现，可扩增出约175 bp的特异性条带，与目的片段大小一致(图1)。

M. DNA标准DL 2 000； 1.阴性对照； 2. sorf1基因的PCR产物

M. DNA Maker DL 2 000; 1. Negative control; 2. PCR product of gene sorf1

图1 sorf1基因PCR产物电泳图
Fig.1 Electrophoresis of PCR product of sorf1 gene

扩增产物经胶回收后，克隆于pMD○R18-T Simple载体中，得到的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，结果表明与GenBank上HVT FC126毒株(AF282130)的sorf1区序列的基因片段序列同源性为100%，表明成功获得目的基因片段。

提取的质粒DNA经紫外分光光度计测定后，浓度为245.3 ng/μL，OD260 nm/OD280 nm比值为1.89，符合纯度要求。经计算该阳性重组质粒的拷贝数为7.8×1010拷贝/μL。

2.2 反应体系的优化结果

根据动力学曲线和扩增效率判定优化的结果，最终确定反应体系为20 μL，即iTaqTMUniversal SYBR○RGreen Supermix 10 μL，上游引物(3 μmol/L)1 μL，下游引物(3 μmol/L)1 μL，质粒p-sorf1 5 μL，ddH2O 3 μL。最佳反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环；4 ℃结束反应。

2.3 Real-time PCR标准品的制备及标准曲线的建立

将p-sorf1重组质粒做梯度稀释制备标准品，稀释浓度分别为7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、7×100拷贝/μL，以各个浓度的质粒作为模板，进行real-time PCR扩增，并绘制标准曲线。试验结果显示，可以获得较为理想的标准曲线(图2)；熔解曲线表明产物的Tm值非常均一(图3)，说明扩增的效率一致；Ct值和标准阳性模板拷贝数的对数间有良好的线性关系(R2为0.99)(图4)，且扩增效率理想(经计算扩增效率为81.7%)(图4)，表明标准曲线能够准确反映目的产物的扩增。

2.4 敏感性及特异性分析

将重组质粒10倍梯度稀释，分别以7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101、7×100拷贝/μL为模板，利用优化的反应条件进行荧光定量，检测结果阳性的最高稀释度的质粒浓度为7×101拷贝/μL(图2)，而标准PCR的检测敏感性为7×102拷贝/μL，real-time PCR比常规PCR的敏感性提高10倍。利用此方法对MDV CVI988/Rispens 株的病毒DNA 及其细菌人工染色体进行了检测，结果均为阴性，说明该方法可以用于对HVT和CVI988病毒鉴别。

1.7×107拷贝/μL；2.7×106拷贝/μL；3.7×105拷贝/μL；4.7×104拷贝/μL；5.7×103拷贝/μL；6.7×102拷贝 /μL；7.7×101拷贝/μL；8.阴性对照

1.7×107copies/μL；2.7×106copies/μL；3.7×105copies /μL；4.7×104copies/μL；5.7×103copies/μL；6.7×102copies/μL；7.7×101copies/μL；8.Negative control

图2 p-sorf1重组质粒real-time PCR扩增曲线
Fig.2 Amplification curve of SYBR Green Ⅰ real-time PCR for detection of p-sorf1

图3 p-sorf1重组质粒real-time PCR熔解曲线导数图Fig.3 Melt curve derivative plot of SYBR Green Ⅰ real-time PCR for detection of p-sorf1

图4 p-sorf1的标准曲线Fig.4 Real-time PCR standard curve of p-sorf1

2.5 重复性分析

将重组质粒分别做3次稀释，选取7×107、7×106、7×105、7×104、7×103、7×102、7×101拷贝/μL重组质粒作为模板，结果见表1。由表1可知，Ct值的变异系数为0.16%～1.44%，说明无论质粒浓度高低，都能获得较好的重复性。

表1 p-sorf1重组质粒real-time PCR重复性试验数据分析Table 1 The Ct analysis of reproducibility for p-sorf1 real-time PCR

2.6 试验样品的分析

将rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT以400 PFU同时分别接种CEF细胞，收集感染后12、24、48、72、96、120 h的细胞，并提取细胞DNA，采用本试验建立的方法对不同时间段的病毒含量进行检测。图5A结果显示，rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT的增殖速度相近，感染48 h后时病毒含量出现明显升高，感染后72 h～96 h为对数增长期，直到感染后120 h都在一直升高。同时，采用蚀斑法进行检测，图5B结果表明，rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT的增殖速度相近，48 h时开始有明显升高，经过72 h～96 h的对数增长期后，开始出现下降。

以1日龄SPF鸡为动物模型，分别接种CEF细胞、rHVT-CMV-pmpD和野生型HVT后不同时间测定HVT的含量。图6检测结果表明，接种后3周才能检测到HVT，直到第5周一直缓慢上升，但是二者各个时间段的病毒拷贝数没有显著性差异。

A.采用定量方法； B.采用蚀斑方法(*表示差异显著)
A. Assay by real-time PCR; B. Assay by plaque (* Mean significant difference)

图5 rHVT-pmpD-N和野生型HVT的体外一步生长曲线
Fig.5 One-step growth curves of rHVT-pmpD-N and parental HVTinvitro

图6 rHVT-pmpD-N和野生型HVT的体内一步生长曲线Fig.6 One-step growth curves of rHVT-pmpD-N and parental HVT in vivo

3 讨论

Real-time PCR是在PCR扩增过程中，通过引入荧光信号对PCR反应进程进行实时检测，已经用于多种病毒的检测，均取得了良好的效果[12-13]。根据real-time PCR化学发光原理可分为两大类，一类为探针类，如TaqMan探针，其原理为通过与靶序列特异性杂交的探针指示扩增产物的增加；另一类为非探针类，如SYBR Green Ⅰ，其原理为利用荧光染料来指示产物的增加。核酸探针特异性好，但是合成成本高、设计难度大，非核酸探针的染料对DNA的识别不具有特异性，非特异性产物如引物二聚体也可与之结合，从而影响定量的准确性，但是可通过优化反应体系和引物设计的改变减少引物二聚体的出现。

HVT基因组为双链DNA，G+C含量为47.5%。共包含有75个ORF，其中67个ORF 存在于包括MDV-1和MDV-2在内的所有的α疱疹病毒中。sorf1基因为HVT所特有的，与编码调节细胞凋亡的Bcl家族中NR-13基因类似。因此,本试验采用sorf1区基因序列进行引物设计，进行特异性扩增，只能获得HVT目的基因，而非MDV Ⅰ、Ⅱ基因，所以能够特异性地检测HVT及HVT载体疫苗。

本试验建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR特异性好，灵敏度高，较标准PCR检测提高1个数量级别。定量试验中，只出现单一峰值，表明引物设计合理，并未出现染料的非特异性结合。通过条件优化，最终获得了较为理想的标准曲线，循环阈值(Ct值)和标准阳性模板起始拷贝数的对数间呈现良好的线性关系，相关系数为0.99(理想值应大于0.98，其值越接近1表明线性关系越好)，扩增效率为81.7%(扩增效率应在0.8～1.2之间，以接近1为最佳)。并且具有良好的重复性和敏感性，可以用于后续的定量检测。一步生长曲线表明，无论在体内还是体外，构建的rHVT-pmpD-N与野生型HVT相比，增殖速度没有发生改变。

综上所述，本试验建立的基于SYBR Green Ⅰ 检测HVT的real-time PCR方法，可实现体内外定性和定量检测HVT及重组HVT，灵敏度高、特异性好、操作简便，对监控HVT的体内体外含量和增殖情况具有一定的实用价值。

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Establishment and Application of SYBR Green Ⅰ Real-time PCR Assays for Detecting HVT

LIU Shan-shan1,2,SUN Wei1,YAN Min-xin1,HUANG Xiu-fen1,JIANG Liang1,HE Cheng2,LI Yong-qing1

(1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,BeijingAcademyofAgriculturalandForestrySciences,Beijing,100097,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

The purpose of this study was to develop a real-time PCR assay to detect and quantify herpesvirus of turkey(HVT)invivoandinvitrotargeting the unique sorf1 gene of the virus. This assay was carried out using a LingtCycler instrument and the product was monitored constinuously with the fluorescent double-stranded DNA binding dye SYBR Green Ⅰ. The duplicate character of wild HVT and recombinant HVT-pmpD-N(rHVT-pmpD-N)was detected using this method. Standard curve was established and the correlation index was 0.99. The result showed that SYBR Green Ⅰ real-time PCR had a minimum detection limit of 7×101copies/μL which was 10 times higher in sensitivity than standard PCR. SYBR Green Ⅰ real-time PCR assay also showed a similar replication rate between wild HVT and rHVT-pmpD-N. It was concluded that this could be an effective, economic and reliable method for rapid detection of wild HVT and recombinant HVT.

Herpesvirus of turkey;SYBR Green Ⅰ;real-time PCR;sorf1

2014-05-29

国家自然科学基金项目(31372420)；北京市科技计划项目(Z121100001212001)

刘杉杉(1986-)，女，山东烟台人，博士研究生，主要从事禽病疫苗和检测方法的研究。*

S852.659.1;Q789

:A

:1007-5038(2015)02-0016-05