硫辛酸对糖尿病肾病大鼠足细胞氧化应激的保护作用

刘洁 王红杰 侯明辉 张晶 张海松

硫辛酸对糖尿病肾病大鼠足细胞氧化应激的保护作用

刘洁 王红杰 侯明辉 张晶 张海松

目的 探讨硫辛酸对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞氧化应激的保护作用。方法 制备糖尿病肾病(DN)大鼠模型，成模后随机选取10只作为DN组(B组)，10只作为硫辛酸干预组(C组)，并设立正常对照组(A组)。实验共13周，于第13周末收集各组大鼠肾组织标本，分别应用硫代巴比妥酸(TAB)法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法测定肾脏中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性，应用western blot、免疫组化测定nephrin、podocin的表达。结果 DN组大鼠肾组织中MDA含量较A组明显升高，T-SOD、GSH-PX活性及nephrin、podocin的表达较A组明显下降(P＜0.05)，而硫辛酸C组大鼠肾组织中MDA含量较DN组明显下降，T-SOD、GSH-PX活性及nephrin、podocin的表达较DN组明显升高(P＜0.05)。结论 硫辛酸可通过抗氧化应激作用抑制足细胞的凋亡，减少尿蛋白，延缓DN的发生发展。

硫辛酸;足细胞;糖尿病肾病;nephrin;podocin

近年来，氧化应激在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病机制中的作用引起人们的广泛关注［1］。研究表明氧化应激可导致足细胞损伤，加重DN 的发生、发展［2］。Nephrin、podocin正常表达于足细胞，是足细胞标志蛋白之一，对维持肾小球正常结构及滤过屏障起重要作用。α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)是一种存在于线粒体的酵素，通过清除氧自由基、还原体内抗氧化系统、螯合金属离子等发挥强抗氧化作用［3］，临床上已被广泛用于治疗糖尿病相关并发症，但有关其对糖尿病肾脏足细胞的保护作用的研究尚少。本研究通过构建DN大鼠模型，探讨硫辛酸对DN大鼠氧化应激及足细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 2月龄健康雄性SD大鼠30只［河北大学实验动物中心提供，合格证号SCXX(京)2009-0004］，平均体重(246.38±6.32)g。普通饲料和高糖高脂饲料(普通饲料中添加10%猪油、2.5%胆固醇和20%蔗糖)均由河北大学实验动物中心提供。STZ购自Sigma公司，用前以0.1 mmol/L，pH值4.2的柠檬酸盐缓冲液溶解，新鲜配成2%STZ溶液，经滤菌器除菌，α-硫辛酸(美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及标本收集:选取大鼠40只，经单侧肾切除后，随机选取10只作为正常对照组(A组)，喂以普通饲料。其余30只大鼠作造模组，高糖高脂饲料喂养4周，禁食12 h后左下腹腔注射STZ(30 mg/kg)。正常对照组注射等量柠檬酸盐缓冲液。STZ注射1周后糖尿病造模组尾静脉取血，以空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或糖负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L者为糖尿病造模成功鼠，继续喂养4周，糖尿病大鼠以随机血糖≥16.0 mmol/L，并出现微量白蛋白尿为DN造模成功鼠，剔出因感染死亡和造模未成功的大鼠，入选DN造模成功鼠为20只，随机分为DN组(B组)和硫辛酸组(C组)，每组10只。分别给予0.9%氯化钠溶液和硫辛酸(50 mg·kg-1·d-1)1 ml腹腔注射4周。实验期间所有大鼠均自由饮水及进食，不给予胰岛素及其他任何降糖药物。4周后用代谢笼收集24 h尿，用于测定尿蛋白(urine protein，UP)，记录体重(body weight，BW);1%戊巴比妥钠(5 ml/kg)腹膜腔注射麻醉成功后股动脉取血，分离血清，用于测定血糖(blood glucose，BG)和血肌酐(serum creatinine，Scr);切取右肾，滤纸吸干血迹后称重，置于冰台上，除掉被膜，取部分肾皮质匀浆后测定丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性，取部分肾组织置于4%多聚甲醛(0.01 mol/L PBS配制)，固定48 h，用于免疫组化检测及Masson染色，其余肾皮质组织迅速置于液氮中按Western blot要求制备蛋白裂解液，-80℃保存。

1.2.2 血、尿生化指标测定:每个样本取20 μl血清和20 μl尿液用AU 2700型自动生化分析仪测定BG、Scr和UP。分别应用硫代巴比妥酸(TAB)法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法测定肾组织中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性。

1.2.3 马松染色:中性甲醛液固定组织，石蜡切片2 μm，常规脱蜡至水;Masson复合染色液5 min;0.2%醋酸水溶液稍洗;5%磷钨酸5～10 min;0.2%醋酸水溶液浸洗2次(1 min×2次);亮绿染色液5 min，0.2%醋酸水洗2次;无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.2.4 免疫组织化学检测大鼠肾组织中nephrin、podocin蛋白表达:石蜡切片常规脱蜡至水，3%双氧水室温避光孵育10 min;蒸馏水冲洗2次，各5 min;抗原修洗2次，各5 min;5 min后取出抗原修复盒，室温自然冷却，约 45 min;0.01 mol/L PBS冲洗 2次，每次5 min，滴加Ⅰ抗，4℃过夜;0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min，滴加Ⅱ抗复合体，37℃孵育30 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min;DAB显色;苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，光镜观察，阳性部位呈棕黄色。免疫组化结果应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统采集图像，并用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析。每张切片肾皮质范围内随机选取10个肾小球(400×)，计算单位面积阳性染色区域平均积分光密度(IOD)，以各组均值进行比较。

1.2.5 Western印迹法检测各组大鼠肾组织中nephrin、podocin蛋白表达:每个样品取 50 μg总蛋白，加6×SDS加样缓冲液，在沸水中变性4 min，经10%SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至PVDF膜;5%脱脂奶粉37℃封闭PVDF膜1.5 h，参考Ⅰ抗的说明书，按照适当比例用3%BSA稀释Ⅰ抗，PVDF膜加入Ⅰ抗4℃孵育过夜，第2天PVDF膜放置在室温30 min，再回收Ⅰ抗并用1×PBS洗涤PVDF膜。参考Ⅱ抗说明书孵育Ⅱ抗，应用辣根过氧化物酶显色，并照相保存。用美国UVP公司LabWorks 4.5软件对Western条带进行定量分析，读取积分光密度值(IOD)。

1.3 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，方差齐性检验用Levene法，计量资料多样本均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肾重/体重、BG、肾功能的改变 第13周末，B组较A组大鼠肾重/体重增加，24 h UP定量明显增加，BG、SCr水平明显升高(P ＜0.05)，C组大鼠肾重/体重，SCr及24 h UP尿蛋白定量较B组明显下降(P ＜0.05)，BG无明显变化(P ＞0.05)。见表1。

表1 3组大鼠BG、肾重/体重、肌酐及尿蛋白的改变n=10，±s

表1 3组大鼠BG、肾重/体重、肌酐及尿蛋白的改变n=10，±s

注:与A组比较，*P ＜0.01;与B组比较，#P ＜0.05

组别 BG(mmol/L)KW/BW(mg/g)UP(mg/24 h) Scr(μmol/L)A组5.62±0.09 7.9±0.79 5.12±0.38 11.87±1.35 B组 29.04±1.49* 23.10±1.02* 24.92±1.20* 35.24±1.03*C组 24.31±1.98* 12.89±1.12# 13.59±1.31# 22.85±1.24#

2.2 3组大鼠肾皮质丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的变化 第13周末，B组肾皮质中MDA的含量较A组大鼠明显升高，而 GSH-Px、SOD活性较 A组大鼠明显降低(P＜0.05)，C组大鼠肾皮质中MDA的含量较B组大鼠明显降低，而GSH-Px、SOD活性较B组大鼠明显升高(P ＜0.05)。见表2。

2.3 肾脏形态学改变 与A组比较，13周时B组肾小球体积增大，系膜细胞增多，基底膜增厚，细胞外基质增多，系膜区Masson绿染胶原纤维增多;而C组肾组织的病理改变较B组明显减轻。见图1。

表2 3组大鼠MDA、GSH-Px、SOD的变化n=10，±s

表2 3组大鼠MDA、GSH-Px、SOD的变化n=10，±s

注:与A组比较，*P ＜0.05;与B组比较，#P ＜0.05

组别 MDA(mmol/g·protein)T-SOD(103U/g·protein) GSH-PX(U)A组3.07±0.15 86.91±6.67 162.67±3.82 B组 12.51±1.16* 40.61±1.70* 85.14±3.25*C组 5.97±0.22# 70.58±4.11# 144.31±3.48#

图1 3组大鼠肾组织Masson染色(Masson染色×400)

2.4 免疫组化检测3组大鼠Nephrin、podocin的表达

与A组比较，B组Nephrin、podocin的表达明显降低(P ＜0.05)，而C组与B组比较，Nephrin、podocin的表达明显上升(P ＜0.05)。见表3，图2。

表3 免疫组化检测3组大鼠Nephrin、podocin的表达n=10，±s

表3 免疫组化检测3组大鼠Nephrin、podocin的表达n=10，±s

注:与A组比较，*P ＜0.05;与B组比较，#P ＜0.05

组别Nephrin podocin A组179.51±13.61 127.40±10.02 B组 66.08±2.70* 52.89±2.73*C组 107.52±9.81# 96.16±5.53#

图2 3组大鼠肾组织Nephrin、podocin的表达(免疫组化×400)

2.5 Western blot检测3组大鼠Nephrin、podocin的表达 与A组比较，B组Nephrin、podocin的表达明显降低(P ＜0.05)，而C组与 B组比较，Nephrin、podocin的表达明显上升(P ＜0.05)。见表4，图3。

表4 Western blot检测3组大鼠Nephrin、podocin的表达n=10，±s

表4 Western blot检测3组大鼠Nephrin、podocin的表达n=10，±s

注:与A组比较，*P ＜0.05;与B组比较，#P ＜0.05

组别Nephrin podocin A组1.087±0.041 1.203±0.015 B组 0.583±0.012* 0.677±0.011*C组 0.835±0.008# 0.983±0.015#

3 讨论

图3 3组大鼠肾组织Nephrin、podocin的表达(western blot)

高血糖引起的氧化应激可通过多种途径参与足细胞的损伤［4］:(1)激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，使足细胞肥大，促进足细胞凋亡［5］;(2)引起糖基化终末产物(AGEs)增多;(3)诱导转化生长因子-β1(TGF-β1)产生增多，TGF-β1可通过激活 p38MAPK和Caspase-3途径引起足细胞凋亡［6］;(4)使PKC活化，通过激活核因子NF-κB，减少一氧化氮产生等多种途径诱导活性氧簇(ROS)产生增多，诱导氧化应激反应，引起细胞凋亡。

肾小球足细胞是高度分化的终末期细胞，对维护肾脏滤过屏障的完整性有重要作用，其功能受损和数量减少在糖尿病患者蛋白尿形成和肾小球硬化过程中起着重要。足细胞分化蛋白nephrin、podocin正常表达于足细胞，是足细胞标志蛋白之一，对维持肾小球正常结构及滤过屏障起重要作用。Nephrin、podocin表达减少是导致 DN持续进展的重要原因［7］。Susztak等［8］通过体外实验观察到，ROS可直接攻击肾小球足细胞，并激活足细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶产生过多的ROS，从而形成恶性循环。本研究采用南京建成试剂盒分别应用硫代巴比妥酸(TAB)法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法测定肾组织中MDA含量和T-SOD、GSH-PX活性。结果显示，DN大鼠肾皮质内MDA含量明显增多，SOD、GSH-Px活力明显下降，足细胞分化蛋白nephrin、podocin表达明显减少，大鼠24 h尿蛋白明显增加，说明氧化应激可使足细胞损伤，导致尿蛋白增加，肾小球硬化，从而促使糖尿病肾病形成和发展。

α-硫辛酸是一种目前在临床广泛应用的强效抗氧化剂，可有效清除体内氧自由基和活性氧，减轻机体OS状态，提高机体抗氧化水平，抑制肾小球硬化、肾小管间质纤维化及减轻足细胞损伤、基底膜增厚，减少尿蛋白排泄［9］等。张春阳等［10］研究发现 α-硫辛酸能够抑制氧化应激所引起的核因子-κB信号通路的激活，从而减轻系膜细胞的增殖。ALA可通过抗氧化作用阻止糖尿病大鼠肾小球足细胞的凋亡，并且α-硫辛酸能降低DN患者血浆中还原型谷胱甘肽的水平，改善血管内皮功能，从而延缓DN的进展。本研究结果表明，C组大鼠 MDA含量较 B组明显降低，而 SOD、GSH-Px活力明显升高，Nephrin、podocin表达较B组增加，24 h尿蛋白明显减少。表明硫辛酸可通过改善早期DN氧化应激水平，减少足细胞的损伤和凋亡，减少尿蛋白的排泄，延缓DN进展。

1 Pan HZ，Zhang L，Guo MY，et al.The oxidative stress status in diabetes mellitus and diabetic nephropathy.Acta Diabetol，2010，47:71-76.

2 Yasuno K，Ishihara S，Saito R，et al.Early-onset podocyte injury and glomerular sclerosis in osborne-mendel rats.Vet Med Sci，2010，72:1319-1327.

3 Ghibu S，Richard C，Delemasure S，et al.An endogenous dithiol with antioxidant properties:alpha-lipoic acid，potential uses in cardiovascular disease.Ann Cardiol Angeiol(Paris)，2008，57:161-165.

4 王彦江，谢席胜，冯胜刚.氧化应激与糖尿病肾病足细胞损伤的研究进展.中国中西医结合肾病杂志，2011，12:651-653.

5 Yoo TH，Li JJ，Kim JJ，et al.Local rennin-angiotensin system is actived in podocytes under diabetic condition.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297:1381-1390.

6 Scheffer M，Bitzer M，Roberts IS，et al.Apoptosis in podocytes induced by TGF-βand Smad7.J Clin Invest，2001，108:807-816.

7 Okamura K，Dummer P，Kopp J，et al.Endocytosis of albumin by podocytes elicits an inflammatory response and induces apoptotic cell death.P Lo S One，2013，8:e54817.

8 Susztak K，Raff AC，Schiffer M，et al.Glucose-induced reactive oxygen species cause apoptosis of podocytes and podocyte depletion at the onset of diabetic nephropathy.Diabetes，2006，55:225-233.

9 Skoberne A，Konieczny A，Schiffer M.Glomerular epithelial cells in the urine:what has to be done to make them worthwhile.Am J Physiol Renal Physiol，2009，296:F230-241.

10 张春阳，邹俊杰，石勇铨，等.α-硫辛酸减轻糖尿病大鼠肾脏损伤的机制.中华内分泌代谢杂志，2010，16:60-62.

Protective effect of the alpha-lipoic acid on oxidative stress in podocytes of rats with diabetic nephropathy

LIU Jie，WANG Hongjie，HOU Minghui，et al．Affiliated Hospital of Hebei University，Hebei，Baoding 071000，China

Objective To investigate the protective effect of alpha-lipoic acid(ALA)on oxidative stress in the podocytes of rats with diabetic nephropathy.Methods After the rat models with diabetic nephropathy were successfully established，the 10 rats were randomly selected as diabetic nephropathy group(group B)，the other 10 rats were regarded as ALA intervention group(group C)，at the sime time，10 normal rats were served as control group(group A).The animals were sacrificed at th end of 13 weeks，and the renal tissues specimens were harvested.The expression levels of nephrin and podocin were detected by Western Blot and immunohistochemistry.The contents of malondialdehyde(MDA)in renal tissues were measured by thiobarbituric acid(TAB)method and the activities of total superoxide dismutase(T-SOD)，glutathione peroxidase(GSH-PX)in renal tissues were detected by xanthine oxidase and dithio-2 nitrobenzoic acid method，respectively.Results As compared with those in group A，the concentrations of MDA in group B were significantly increased，however，the acticities of T-SOD ，GSH-PX and the expression levels of nephrin，podocin were significantly decreased(P ＜0.05).As compared with those in group B，the concentrations of MDA were obviously decereased，but the acticities of T-SOD ，GSH-PX and the expression levels of nephrin，podocin were significantly increased in group C(P ＜0.05).Conclusion ALA can inhibit the apoptosis of podocyte，reduce the urine protein and delay the pathogenesis and development of diabetic nephropathy through antioxidative stress effects.

alpha-lipoic acid;podocyte;diabetic nephropathy;nephrin;podocin

R 392.11

A

1002-7386(2015)23-3525-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．001

项目来源:保定市科学技术研究与发展指导计划项目(编号:11F07)

071000 河北省保定市，河北大学附属医院

张海松，071000 河北省保定市，河北大学附属医院;E-mail:hdfyzhs1665@sina.com

2015-05-05)