瑞舒伐他汀对急性心肌梗死患者行择期PCI术后外周血TLR4表达及炎性因子的影响

路妍 张建华

瑞舒伐他汀对急性心肌梗死患者行择期PCI术后外周血TLR4表达及炎性因子的影响

路妍 张建华

目的 观察急性心肌梗死患者行择期经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后外周血单核细胞Toll样受体4(TLR4)表达变化，同时观察瑞舒伐他汀强化治疗对TLR4及炎性因子的影响。方法 选取急性心肌梗死患者90例为病例组。同期进行健康体检的正常人70例为对照。采用Real time-PCR和Western blot测定外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达。采用Gensini评分判定冠脉病变严重程度。病例组随机分为治疗A组和治疗B组，每组45例，2组均接受常规治疗，治疗B组在常规治疗基础上于PCI术前7 d给予口服瑞舒伐他汀10 mg/d。观察2组术前、术后7 d左心室射血分数(LVEF)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、TLR4 mRNA和蛋白表达及hs-CRP、TNF-α、IL-6水平变化。结果 (1)对照组比较，病例组外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。且随着冠脉病变严重程度增加，外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达逐渐升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。相关性分析显示，外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达与冠脉病变严重程度具有正相关性(P＜0.05)。(2)病例组治疗后与术前比较，术后7 d治疗A组和治疗B组LVEF均显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，且治疗B组显著高于同期治疗A组(P＜0.05)。术后7 d治疗A组和治疗B组LVESD、LVEDD、TLR4 mRNA和蛋白表达、hs-CRP、TNF-α、IL-6水平均显著降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)，且治疗B组显著低于同期治疗A组(P＜0.05)，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 急性心肌梗死患者行择期PCI术前短期应用瑞舒伐他汀能够显著改善心功能，其机制与抑制TLR4炎症信号通路激活有关。

瑞舒伐他汀;急性心肌梗死;择期;冠状动脉介入治疗;Toll样受体4

冠心病是严重影响中老年人群生命安全和生活质量的常见心血管疾病之一，病死率和致残率高，预后差［1］。近年来，经皮冠状动脉介入术(PCI)已经成为治疗急性心肌梗死的首选治疗手段。但是，PCI术后通过诱导局部炎性反应导致心肌损伤及主要不良心血管事件发生，是患者预后不良的独立危险因素［2，3］。研究显示，Toll样受体4(TLR4)炎症信号通路激活后通过促进核因子-κB(NF-κB)的激活和核转位，上调hs-CRP、TNF-α、IL-6 等炎性因子的表达，在动脉粥样硬化斑块不稳定性中发挥重要作用［4］。然而，TLR4表达水平在急性心肌梗死发生发展和冠脉病变严重程度的关系及瑞舒伐他汀强化治疗对其表达的影响目前报道尚少。本研究旨在观察急性心肌梗死患者外周血单核细胞TLR4的表达变化及择期PCI术前瑞舒伐他汀治疗对TLR4表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年3月至2015年3月我院收治的急性心肌梗死患者90例为病例组，随机分为治疗A组和治疗B组，每组45例。治疗A组男25例，女20例;年龄35～70岁，平均年龄(58.85±8.67)岁;治疗B组男28例，女17例;年龄33～72岁，平均年龄(59.21±8.90)岁。2组年龄、性别比、原发疾病、Killip分级、梗死部位等一般资料比较差异无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。见表1。

表1 2组一般资料比较 n=45

1.2 纳入及排除标准 纳入标准:(1)心肌缺血引起的胸痛症状持续时间超过30 min;(2)心电图具有典型的动态变化，即至少2个以上相邻导联ST段抬高;(3)血清心肌坏死标志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)等水平升高超过正常者2倍以上;(4)发病持续时间超过1 d，不符合急诊PCI指征;(5)所有患者均签署知情同意书。排除标准:(1)合并心、肝、肺、肾等重要脏器功能不全者;(2)凝血功能障碍患者;(3)自身免疫性疾病、脑卒中、恶性肿瘤患者;(4)有他汀类药物过敏史者。

1.3 治疗方法 治疗A组和治疗B组均给予肠溶阿司匹林抗凝、β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、氯吡格雷等常规治疗。治疗B组在常规治疗基础上术前7 d口服瑞舒伐他汀(舒夫坦，南京先声东元制药有限公司)10 mg/d，1次/d，睡前服用。

1.4 检测方法

1.4.1 Real time-PCR:根据GeneBank中人TLR4 mRNA序列，采用Primer软件设计引物，由上海生物工程有限公司合成。Trizol提取外周血单个核细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。以总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书进行操作，合成cDNA第1链。PCR反应在ABI 7300型实时荧光定量PCR仪上进行，扩增完毕后进入仪器自带的SDS v1.3软件结果分析界面，使用SPSS 10.0统计计算样品间Ct值。设对照组样品为标准1，目的基因mRNA相对表达水平为2-△△Ct，设β-actin为内参照基因。见表2。

表2 Real time-PCR引物序列及扩增产物长度

1.4.2 Western blot:外周血单个核细胞加入RIPA裂解液200 μl，冰上放置30 min充分裂解细胞。提取细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，每组取100 μg总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳，将目的蛋白电转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉室温震荡封闭2 h。加入特异性一抗孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，ECL化学发光法显色、定影。

1.4.3 ELISA法:分别于PCI术治疗前后抽取患者清晨空腹静脉血2 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存备用。采用 ELISA法测定血清 hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。严格按照试剂盒说明书操作。960酶标仪购自美国Sigma公司。

1.4.4 心功能检测:采用高分辨率彩色多普勒超声诊断仪(美国PHILIPS公司)观察心功能相关指标，包括左心室射血分数(LVEF)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)。

1.5 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和病例组外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达比较 与对照组比较，病例组外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表3。

2.2 不同病变支数病例组患者外周血单核细胞TLR4mRNA和蛋白表达比较 与对照组比较，随着病变支数的增加，病例组患者外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达逐渐升高，两两相比差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表3 对照组和急性心肌梗死患者组外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达比较±s

表3 对照组和急性心肌梗死患者组外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达比较±s

注:与对照组比较，*P＜0.05

组别 TLR4 mRNA相对表达水平TLR4蛋白相对表达水平对照组(n=70)0.78±0.12 0.57±0.09病例组(n=90) 4.99±0.74* 4.68±0.65*

表4 不同病变支数病例组患者外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达比较±s

表4 不同病变支数病例组患者外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达比较±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与1支病变比较，#P ＜0.05;与2支病变比较，△P ＜0.05

组别 TLR4 mRNA相对表达水平TLR4蛋白相对表达水平对照组(n=70)0.78±0.12 0.57±0.09病例组1支病变(n=36) 3.46±0.53* 3.28±0.49*2支病变(n=33) 4.77±0.71*# 4.46±0.63*#3支病变(n=21) 5.64±0.82＊△ 5.38±0.77＊△

2.3 病例组患者外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达与冠脉病变严重程度的关系 Sperman相关分析结果显示，病例组患者外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达与冠脉病变支数呈正相关性，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.4 病例组治疗前后心功能比较 术前治疗A组和治疗B组LVEF、LVESD、LVEDD比较差异无统计学意义(P＞0.05)。术后7 d 2组LVEF均较术前显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，且治疗B组显著高于同期治疗A组(P＜0.05);术后7 d 2组LVESD、LVEDD均较术前显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，且治疗B组显著低于同期治疗A组(P＜0.05)。见表5。

表5 病例组治疗前后心功能比较n=45，±s

表5 病例组治疗前后心功能比较n=45，±s

注:与术前比较，*P＜0.05;与治疗A组比较，#P ＜0.05

组别 LVEF(%) LVESD(mm) LVEDD(mm)治疗A组术前 31.78±4.53 52.89±6.33 69.31±7.65术后7 d 36.89±5.05* 49.92±5.35* 63.29±6.40*治疗B组术前 32.12±4.67 53.02±6.42 69.12±7.58术后7 d 40.11±6.23*# 45.06±4.23*# 57.21±6.23*#

2.5 病例组治疗前后TLR4 mRNA和蛋白表达比较

术前治疗A组和治疗B组TLR4 mRNA和蛋白表达比较差异无统计学意义(P＞0.05);术后7 d 2组TLR4 mRNA和蛋白表达均较术前显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，且治疗B组显著低于同期治疗A组(P ＜0.05)。见表6。

表6 病例组治疗后TLR4 mRNA和蛋白表达比较n=45，±s

表6 病例组治疗后TLR4 mRNA和蛋白表达比较n=45，±s

注:与术前比较，*P ＜0.05;与治疗A组比较，#P ＜0.05

组别 TLR4 mRNA相对表达水平 TLR4蛋白相对表达水平治疗A组术前 4.95±0.70 4.62±0.62术后7 d 3.52±0.49* 3.31±0.36*治疗B组术前 5.04±0.78 4.72±0.69术后7 d 2.68±0.42*# 2.47±0.33*#

2.6 病例组治疗前后炎性因子比较 术前治疗A组和治疗B组hs-CRP、TNF-α、IL-6比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。术后7 d 2 组 hs-CRP、TNF-α、IL-6 均较术前显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，且治疗B组显著低于同期治疗A组(P＜0.05)。见表7。

表7 病例组治疗前后炎性因子比较n=45，±s

表7 病例组治疗前后炎性因子比较n=45，±s

注:与术前比较，*P ＜0.05;与治疗A组比较，#P ＜0.05

组别 hs-CRP(mg/L) TNF-α(ng/L) IL-6(pg/L)治疗A组术前 34.15±5.23 278.56±17.29 43.65±5.34术后7 d 21.33±3.24* 157.43±11.43* 26.77±4.12*治疗B组术前 32.87±5.02 282.34±19.32 41.38±5.12术后7 d 10.42±1.46*# 54.16±7.45*# 13.34±2.02*#

3 讨论

研究显示，TLR4炎症信号通路的激活在冠状动脉粥样硬化发生发展中发挥关键作用［5］。TLR4信号通路通过MyD88依赖性和MyD88非依赖性途径促进NF-κB 的活化和核转位，从而上调 hs-CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子的表达和释放，导致斑块不稳定性增加及冠心病的发生发展［4］。hs-CRP是机体炎性反应的敏感性标志物，能够促进TNF-α、IL-6表达，与炎症程度、不良心血管事件发生及预后呈正相关［6］。TNF-α是主要有活化巨噬细胞分泌的促炎因子，能够抑制心肌收缩力、激活并诱导中性粒细胞在组织的积聚，从而加重局部炎性反应［7］。IL-6是单核细胞、巨噬细胞分泌的关键促炎因子，具有促进斑块形成的作用并导致斑块不稳定性增加。基础和临床研究证实，急性心肌梗死患者尤其是合并不良心血管事件的患者外周血和不稳定斑块中TLR4、TNF-α、IL-6等促炎因子水平显著升高，预示患者预后不良［8，9］。本研究结果显示，病例组患者外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白表达较健康对照组显著升高，且其表达与冠脉病变严重程度具有正相关性(P ＜0.05)，与前人报道［10］一致，说明急性心肌梗死患者外周血单核细胞TLR4表达与主要心血管不良事件发生及患者预后密切相关。

临床研究证实，术前强化瑞舒伐他汀治疗对PCI术后心肌损伤具有明显保护作用，能够明显降低心血管事件发生率，但其具体机制尚不清楚［11］。本研究结果显示，病例组经治疗后，治疗B组PCI术后LVEF显著高于治疗 A组，LVESD、LVEDD、TLR4 mRNA和蛋白表达、hs-CRP、TNF-α、IL-6显著低于治疗 A 组，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明PCI术前强化瑞舒伐他汀治疗可能通过下调TLR4表达抑制炎性反应，稳定粥样斑块并减少不良心血管事件发生。

综上所述，急性心肌梗死患者外周血单核细胞TLR4表达显著升高，且与冠脉病变严重程度密切相关。PCI术前强化瑞舒伐他汀治疗能够明显改善患者心功能，其机制与下调外周血单核细胞TLR4表达，进而抑制炎性反应有关。

1 Ludman A，Venugopal V，Yellon DM，et al.Statins and cardioprotection more than just lipid lowering Pharmacology ＆ Therapeutics，2009，122:30-43.

2 Su Q，Li L，Liu Y，et al.Effect of intensive atorvastatin therapy on periprocedural PDCD4 expression in CD4+ T lymphocytes of patients with percutaneous coronary intervention.Cardiology，2014，127:169-175.

3 Dumitriu IE，Baruah P，Finlayson CJ，et al.High levels of costimulatory receptors OX40 and 4-1BB characterize CD4+CD28 null T cells in patients with acute coronary syndrome.Circ Res，2012，110:857-869.

4 Jia SJ，Niu PP，Cong JZ，et al.TLR4 signaling:a potential therapeutic target in ischemic coronary artery disease.Int Immunopharmacol，2014，23:54-59.

5 Kashiwagi M，Imanishi T，Ozaki Y，et al.Differential expression of Tolllike receptor 4 and human monocyte subsets in acute myocardial infarction.Atherosclerosis，2012，221:249-253.

6 王哲颖，孙剑锋，王锐，等.瑞舒伐他汀对急性冠脉综合征患者hs-CRP和IL-18水平及预后的影响.中国老年学杂志，2013，33:2868-2869.

7 Kotani T，Takeuchi T，Takai S，et al.Serum levels of matrix metalloproteinase(MMP)9，a risk factor for acute coronary syndrome，are reduced independently of serum MMP-3 by anti-TNF-α antibody(infliximab)therapy in patients with rheumatoid arthritis.J Pharmacol Sci，2012，120:50-53.

8 Hu ZP，Fang XL，Fang N，et al.Melatonin ameliorates vascular endothelial dysfunction，inflammation，and atheroscelrosis by suppressing the TLR4/NF?κB system in high-fat-fed rabbits.J Pineal Res，2013，55:388-398.

9 Ishikawa Y，Satoh M，Itoh T，et al.Local expression of Toll-like receptor 4 at the site of ruptured plaques in patients with acute myocardial infarction.Clin Sci(Lond)，2008，115:133-140.

10 赵乃倩，荣青峰，魏晓霞，等.ST段抬高型心肌梗死患者入院血糖与外周血单个核细胞TLR4表达和活性的关系.中华临床医师杂志(电子版)，2015，9:2051-2056.

11 殷宇刚，王滨.瑞舒伐他汀对冠状动脉支架植入术后再狭窄以及血脂和炎症因子的影响.第二军医大学学报，2011，32:227-228.

Effects of rosuvastatin on Toll-like receptor 4 expression in peripheral blood monouclear cell and on inflammatory factor in patients with acute myocardial infarction after selective percutaneous coronary intervention

LU Yan，ZHANG Jianhua．Department of Internal Medicine，Gneral Hospital of Jizhong Energy Sources Fengfeng Group，Hebei，Handan 056002，China

Objective To observe the change of Toll-like receptor 4(TLR4)in acute myocardial infarction(AMI)patients undergoing selective percutaneous coronary intervention(PCI)and to investigate the effects of rosuvastatin on Toll-like receptor 4 expression in peripheral blood monouclear cell and on inflammatory factor.Methods A total of 90 patients with AMI treated by PCI were enrolled in the study.Meanwhile 70 healthy subjects were served as control group.Real time-PCR and Western Blot were used to detect the expression levels of TLR4 mRNA and protein.Gensini score was used to evaluate the severity of coronary artery lesions.The 90 patients were randomly divided into two groups:group A and group B，with 45 patients in each group.The patients in both groups

routine therapy，however，the patients in group B，on the basis of routine therapy，were given orally rosuvastatin(10mg/d)on 7 days before PCI.The changes of LVEF，LVESD，LVEDD，TLR4 mRNA and protein，hs-CRP，TNF-α，IL-6 were detected before surgery and on 7d after surgery.Results As compared with those in control group，the expression levels of TLR4 mRNA and protein were significantly increased in patients with AMI(P ＜0.05).Moreover the expression levels of TLR4 mRNA and protein were gradually increased，with the increasing of severity of coronary lesions(P＜0.05).The correlation analysis showed that the expression levels of TLR4 mRNA and protein were positively correlated to the severity of coronary lesions(P＜0.05).As compared with that before therapy，LVEF in both treatemt groups were significantly increased on 7d after PCI(P ＜0.05)，furthermore，LVEF in group B was significantly higher than that in group A(P ＜0.05).The levels of LVESD，LVEDD，TLR4 mRNA and protein，hs-CRP，TNF-α，IL-6 in both treatment groups were significantly decereased on 7d after PCI，as compared with those before surgery(P ＜0.05)，moreover，which in group B were significantly lower than those in group A(P ＜0.05).Conclusion The short-term application of rosuvastatin before elective PCI surgery in patients with AMI can obviously improve patient’s cardiac function，and its action mechanism may be related with inhibiting the activation of TLR4 signal transduction pathway.

rosuvastatin;acute myocardial infarction;selective period;percutaneous coronary intervention therapy;Toll-like receptor 4

R 542.22

A

1002-7386(2015)23-3544-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．007

056002 河北省邯郸市，冀中能源峰峰集团总医院邯郸院区内科

2015-07-20)