上皮性卵巢癌组织中HE4和CD133的表达及临床意义

陆冬梅 杨俊红

上皮性卵巢癌组织中HE4和CD133的表达及临床意义

陆冬梅 杨俊红

目的 探讨人附睾蛋白HE4和CD133在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义。方法 收集病理标本采用免疫组化法检测上皮性卵巢癌组织(n=57)及正常卵巢组织(n=19)HE4和CD133的表达情况。分别研究HE4和CD133与各临床病理参数的关系并进行相关性分析。结果 HE4在正常卵巢组和上皮性卵巢癌组中阳性表达率分别为42.1%(8/19)、71.9%(41/57)，CD133在2组中阳性表达率分别为31.6%(6/19)、68.4%(34/57)，差异有统计学意义(P＜0.05)。HE4和CD133的表达均与临床病理分期、组织分化程度、绝经状态和淋巴结转移有显著相关性(P＜0.05)。Spearman相关性分析显示HE4表达与CD133的表达有相关性(r=0.340，P=0.006)。结论 HE4和CD133的高表达可能与上皮性卵巢癌的发生、发展有一定关系。

上皮性卵巢癌;HE4;CD133;免疫组化

卵巢癌是女性三大恶性肿瘤之一，其进展迅速，预后差［1］。卵巢癌患者起病比较隐匿，待确诊时多为晚期，上皮性卵巢癌(EOC)患者的五年生存率大约为30%。肿瘤的生物学行为包括增殖、浸润、转移、复发并涉及许多蛋白分子的表达。肿瘤标志物HE4在临床上已用于卵巢癌的鉴别诊断、复发和预后评价［2，3］。CD133作为肿瘤干细胞标志物，与许多恶性肿瘤的发生发展关系密切［4-6］。本研究应用免疫组化SP法检测EOC组织中HE4及CD133的表达，研究它们与EOC临床病理特征之间的关系。为探讨 HE4及CD133在EOC发生发展中的生物学作用及进一步临床诊断和治疗提供思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年5月至2014年5月于本院妇科门诊经病理确诊并排除其他卵巢病变的上皮性卵巢癌患者病例57例，正常卵巢组织19例，收集相关临床资料。卵巢癌患者手术时的组织标本要避开坏死和炎症区域，对照组卵巢组织均来自子宫多发肌瘤同时一行卵巢切除者。所有标本采集后立即放入10%甲醛固定液中固定，2 h内石蜡包埋固定保存，4 μm厚度连续切片。所有病理切片均由两位资深的病理科医生进行核对分析。患者年龄31～74岁，中位年龄54.1岁，TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期38例;病理类型:浆液性腺癌31例，粘液性腺癌12例，子宫内膜样腺癌14例;绝经病例35例，未绝经病例22例。高中分化EOC 31例，低分化EOC 26例。淋巴转移患者36例，淋巴无转移患者21例。所有患者未合并其他肿瘤及严重内科病，组织取材前无放化疗治疗。

1.2 主要试剂 抗体试剂兔抗人HE4及CD133多克隆抗体工作液(Santa Cruz Biotechnology公司，美国)，山羊抗兔二抗(Sigma公司，美国)，SP法免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，中国)。梯度乙醇、PBS缓冲液(pH值7.4)、抗原修复液、二甲苯、过氧化氢、中性树胶等试剂均由本院病理科提供。HE4及CD133的染色具体操作步骤按照试剂盒要求进行。

1.3 免疫组化法 采用免疫组化SP法检测EOC及正常卵巢组织中HE4及CD133的表达量。石蜡包埋标本经加热脱蜡和逐级酒精水化，切片采用微波炉加热法95℃ 15 min进行抗原修复，取出后室温冷却30 min，室温下加入 HE4和 CD133多克隆抗体(1∶200)孵育40 min，PBS清洗3次后37℃湿盒中加二抗孵育30 min，PBS再次漂洗后加50 μl DAB显色液，PBS漂洗3次苏木素染核5 min。切片经盐酸分化后行酒精脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片保存。使用试剂要求的已知免疫组化片作为阳性对照，PBS代替一抗的免疫组化片作为阴性对照。

1.4 结果判定标准 HE4及CD133均表达于细胞质中，免疫组化染色以黄色颗粒视为阳性，评定原则为染色强度和阳性染色细胞百分率综合分析。初步根据染色强度粗略给分:无染色0分;淡黄色1分;浅褐色2分;深褐色3分。阳性细胞百分比计分:无阳性细胞为0，1% ～25%，26% ～50%，51% ～75%，＞75%分别打分为0分，1分，2分，3分，4分。染色强度计分乘以阳性细胞百分率等于蛋白表达数值，以0～2分定为阴性，阳性表达＞3分。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关分析用Spearman检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组织HE4的表达 HE4在EOC组织中的阳性表现为胞膜和胞浆内均有棕黄色颗粒，蛋白阳性表达率为71.9%，前者明显高于正常卵巢组织中HE4的表达率(42.1%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1，表1。

2.2 CD133在卵巢癌和正常卵巢上皮中的表达CD13在EOC细胞浆内有棕黄色均匀颗粒染色，蛋白阳性表达率分别为68.4%，而正常卵巢组织中的表达率为31.6%，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1，表1。

2.3 HE4在卵巢癌中的表达与临床病理参数的关系HE4表达与年龄、肿瘤病理类型无关(P＞0.05)。HE4的表达与临床分期、组织分化程度、绝经状态及淋巴结转移密切相关(P＜0.05)，即在临床晚期、低分化组、绝经组及淋巴结转移组HE4的蛋白阳性表达率分别为84.2%、92.3%、91.4%和83.3%，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

图1 卵巢癌组织中HE4和CD133的阳性表达(免疫组化染色×400)A HE4在正常卵巢癌组织中的表达;B HE4在EOC组织中的表达;C CD133在正常卵巢癌组织中的表达;D CD133在EOC组织中的表达

表1 两种组织中HE4和CD133的阳性表达率 例(%)

2.4 CD133在卵巢癌中的表达与临床病理参数的关系 肿瘤上皮标记物CD133的表达水平和EOC临床病理各参数的关系与HE4基本一致，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 HE4及CD133与EOC临床病理特征的关系 例(%)

2.5 HE4和CD133在上皮性卵巢癌组织中的相关性分析 57例上皮性卵巢癌中HE4与CD133均阳性表达者29例，均阴性表达者11例，12例HE4表达阳性而CD133阴性表达，5例HE4表达阴性而CD133阳性表达;两者卵巢癌中的蛋白表达强度呈正相关(r=0.340，P=0.006)。见表3。

3 讨论

卵巢癌发病隐蔽，在女性生殖肿瘤中的死亡率占第一位，它从早期症状到被确诊癌细胞多数已扩散，而晚期肿瘤治疗效果一般很差，其5年生存率极低。EOC在卵巢恶性肿瘤最多见［7］，因此我们就 EOC中相关蛋白分子的表达情况做此研究。

表3 EOC组织中HE4及CD133表达的相关性分析 例

HE4最早被发现于人类的附睾上皮细胞中，在女性正常生殖道上皮也有一定表达，基因WFDC2位于染色体20q12-13.1上，编码分子量约25 kD的小分子分泌性糖蛋白。HE4具有抗蛋白酶活性并可能参与精子成熟。研究显示卵巢癌标志物HE4在人类多种恶性肿瘤组织包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌等均有较高表达［8］。但在卵巢癌中表达尤为明显，约93%的浆液性上皮性卵巢癌表达HE4蛋白。本研究表明HE4阳性表达率在临床晚期，低分化癌及全身淋巴结转移患者的EOC组织中增高，说明HE4与肿瘤的恶性程度相关。绝经组表达高于未绝经组，说明绝经引起的激素或微环境的改变可能对肿瘤细胞的转移和侵袭有利。本研究发现HE4表达与病理类型无关，与相关研究［9］不一致，可能我们分类太笼统，简单分为浆液型卵巢癌和非浆液性卵巢癌，而后者HE4表达阳性高的子宫内膜样卵巢癌组织标本较多。

120 kDa的跨膜糖蛋白CD133最早发现于造血干细胞和神经上皮干细胞表面，参与正常细胞膜形成过程。CD133在多种肿瘤中被发现，与肿瘤的恶性表型、浸润和转移能力有关［10］。我们发现随着卵巢癌组织分化程度降低、临床分期及淋巴结转移增高，CD+133肿瘤细胞比率也明显增高，说明它与卵巢癌的恶化程度呈正相关。这与HE4在上皮性卵巢癌中的研究类似，提示二者在卵巢癌的浸润和转移中发挥了重要的作用。

本研究发现HE4和CD133蛋白在卵巢癌和正常卵巢组织中均有表达，且癌症组明显高于正常组，这与目前相关研究结果一致。另外上皮性卵巢癌组织中HE4和CD133与卵巢癌病变程度有明显相关性，且二者表达呈正相关。CD+133癌细胞上高表达HE4可能促进肿瘤细胞向淋巴结的侵袭，进而加快肿瘤的全身转移。尤其是卵巢癌患者的绝经状态与HE4和CD133表达均有关，这可能因为绝经期的女性免疫功能、内分泌、遗传、精神因素均有所改变［11］。我们认为联合检测HE4和CD133利于阐明卵巢肿瘤发生发展、浸润和转移等肿瘤生物行为学规律，为上皮性卵巢癌早期诊断和恶性程度、预后转归提供参考依据。

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3 Chen WT，Gao X，Han XD，et al.HE4 as a serum biomarker for ROMA prediction and prognosis of epithelial ovarian cancer.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15:101-105.

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5 Skubitz AP，Taras EP，Boylan KL，et al.Targeting CD133 in an in vivo ovarian cancer model reduces ovarian cancer progression.Gynecol Oncol，2013，130:579-587.

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8 Lamy PJ，Roques S，Viglianti C，et al.HE4，a novel marker for epithelial ovarian cancer:evaluation of analytical performances.Annales de biologie Clinique，2010，68:325-329.

9 Zheng H，Gao YN，Gao WJ，et al.Expression of serum human epididymis protein 4 in epithelial ovarian cancer and its correlation with prognosis.Zhong hua zhong liu za zhi.2013，35:445-449.

10 Skubitz AP，Taras EP，Boylan KL，et al.Targeting CD133 in an in vivo ovarian cancer model reduces ovarian cancer progression.Gynecol Oncol，2013，130:579-587.

11 Macuks R，Baidekalna I，Donina S.Diagnostic test for ovarian cancer composed of ovarian cancer symptom index，menopausal status and ovarian cancer antigen CA125.Gynecol Oncol，2011，32:286-288.

Expression and clinical significance of TH4 and CD133 in epithelial ovarian cancer

LU Dongmei，YANG Junhong．Department of Gynaecology and Obstetrics，Tangshan Institute for Maternal and Child Health，Hebei，Tangshan 063000，China

Objective To explore the expression and clinical significance of HE4 and CD133 in epithelial ovarian cancer(EOC).Methods The expression levels of HE4 and CD133 protein were detected in 57 cases of EOC tissues(EOC group)and 19 cases of normal ovarian tissues(control group)by immunohistochemistry.The correlation between the expressions of TH4，CD133 and clinicopathological parameters was analyzed.Results The positive expression rates of HE4 in control group and in EOC group were 42.1%(8/19)，71.9%(41/57)，respectively，and the positive expression rates of CD133 in the two groups were 31.6%(6/19)，68.4%(34/57)，respectively，there were significant differences between two groups(P ＜0.05).The expressions of HE4 and CD133 were closely correlated to clinical pathological staging，histodifferentiation degree，menopausal state，lymph node metastasis(P ＜0.05).Spearman correlation analysis showed that the expression of HE4 was closely related to that of CD133(r=0.340，P ＜0.01).Conclusion The overexpression of HE4 and CD133 protein may be correlated to the pathogenesis and development of EOC.

epithelial ovarian cancer;HE4;CD133;immunohistochemistry

R 737.31

A

1002-7386(2015)23-3538-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．005

063000 河北省唐山市妇幼保健院妇产科

2015-01-20)