丹参酮ⅡA磺酸钠在低氧下对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和促纤维化因子表达的影响*

康春福 陈 斌 秦泽莲 孙 艳 李艳芳 于东宁 安 阳 毕洪森

(北京大学第三医院成形外科，北京 100191)



·基础研究·

丹参酮ⅡA磺酸钠在低氧下对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和促纤维化因子表达的影响*

康春福 陈 斌 秦泽莲**孙 艳①李艳芳①于东宁②安 阳 毕洪森

(北京大学第三医院成形外科，北京 100191)

目的 研究常氧和低氧下，丹参酮ⅡA磺酸钠(sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts, KFs)增殖和促纤维化因子表达的影响，探讨STS治疗瘢痕疙瘩的可能作用。 方法 原代培养5例KFs，将细胞分组，分别在常氧(21%O2)和低氧(2%O2)下用不同剂量的STS(0、50、100、200、400、800 μmol/L)干预48 h，采用CCK-8方法检测细胞增殖活力，同时在倒置相差显微镜下观察细胞的形态学变化。用不同剂量的STS(0、100、200 μmol/L)同样干预48 h，实时定量PCR检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)、血管内皮生长因子(VEGF)、成骨细胞特异因子2(Periostin)的mRNA表达情况，蛋白质印迹法检测HIF-1α、TGF-β1蛋白的表达情况。 结果低氧与常氧下的KFs增殖活力无明显差异；STS在常氧和低氧下明显抑制KFs增殖(P<0.01)，其有剂量依赖性，在低氧条件下STS的起效剂量比常氧下的高。低氧能够引起HIF-1α的mRNA和蛋白分别增加0.606(P=0.037)、0.950(P=0.002)，VEGF mRNA上调7.256(P=0.043)，Periostin mRNA上调6.285(P=0.006)，TGF-β1蛋白增加1.641(P=0.011)，对Col Ⅰ和Col Ⅲ的mRNA的表达无明显影响。常氧下，200 μmol/L的STS增加HIF-1α和Periostin的mRNA表达分别为0.750(P=0.015)和8.553(P=0.000)，减少TGF-β1、Col Ⅰ和Col Ⅲ的mRNA表达分别为0.349(P=0.007)、0.320(P=0.006)、0.453(P=0.015)，对TGF-β1蛋白和VEGF mRNA表达影响不明显。低氧48 h，200 μmol/L的STS使HIF-1α mRNA和蛋白表达分别减少0.548(P=0.016)、0.984(P=0.001)，对TGF-β1 mRNA和蛋白以及Col Ⅰ、Col Ⅲ、VEGF、Periostin的mRNA表达影响不明显。 结论 常氧和低氧下STS对KFs的增殖均有抑制作用，并能够影响促纤维化因子的表达，可能作为治疗瘢痕疙瘩的潜在药物。

丹参酮ⅡA磺酸钠； 瘢痕疙瘩成纤维细胞； 低氧； 增殖； 基因表达

瘢痕疙瘩(keloid)是以瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts，KFs)异常增殖和细胞外基质过度沉积为主要病理特征的皮肤纤维化疾病，常在皮肤损伤后发生，具有超出原损伤范围、不能自发消退、手术切除后易复发的表现。目前，其发病机制尚未阐明，也无满意的治疗药物，严重影响了包括微创手术在内的各种手术后伤口愈合质量，伤口瘢痕疙瘩的形成也给患者带来巨大的心理创伤。研究显示瘢痕组织中存在因血管闭塞等引起的血供不足及缺氧的微环境[1,2]，可能是引起创伤过度愈合、皮肤纤维化增生形成瘢痕疙瘩的机制之一[3]。丹参及其有效成分丹参酮ⅡA在多个器官(肝、心、肺、肾等)的抗纤维化作用已有报道[4～7]，研究表明其主要通过抑制成纤维细胞的增殖和胶原分泌等发挥作用。丹参酮ⅡA磺酸钠(sodium tanshinone ⅡA sulfonate，STS)是丹参酮ⅡA经磺酸化后得到的水溶性药物，药效更强。本实验利用培养的KFs，并尝试模拟瘢痕疙瘩体内低氧微环境，观察常氧和低氧下，STS对KFs增殖及促纤维化因子的影响，探讨STS是否具有抑制瘢痕疙瘩形成的药理作用。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究经北京大学第三医院伦理委员会批准(批文号IRB00006761-2014173)，在患者知情同意下，取5例瘢痕疙瘩切除术后废弃的标本，患者术前均未使用过类固醇激素、抗肿瘤药物和放射治疗等，男1例，女4例，年龄分别为4、19、30、52、54岁，瘢痕位于耳部3例，胸部2例。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素双抗(以色列BioInd公司)，DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)高糖培养基(美国GIBCO公司)，丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(上海第一生化药业有限公司)，CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒(日本同仁)，低氧诱导因子1α(HIF-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)抗体(abcam公司)，以上试剂均为市售；引物由上海生工公司设计合成。细胞培养箱、自动酶标仪产自美国Thermo公司；DMIL倒置显微镜产自德国Leica公司；Odyssey双色红外荧光成像系统产自美国LI-COR公司；荧光定量PCR仪(IQ5)产自美国Bio-Rad公司，流式细胞仪为BD公司的FACSAria Ⅱ定制系统。

1.2.2 瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养 严格按照无菌操作原则，用含有5%青霉素和链霉素双抗的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)将标本漂洗干净，再彻底去除标本的表皮和皮下脂肪组织，剪成约0.5 mm×0.5 mm大小的贴壁用组织块，均匀接种于培养瓶中进行原代及传代培养。5例细胞分开培养，采用第3～8代进行实验。

1.2.3 STS对KFs形态学的影响 将KFs传代接种于6孔培养板中，常氧下培养过夜，加入STS，调整剂量为0、50、100、200、400、800 μmol/L，再分别置于常氧(21%O2)或低氧(2%O2)下培养48 h，利用倒置显微镜直接进行观察。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖活力 按每孔1500个/100 μl将KFs接种于96孔板，常氧条件下培养过夜，加入STS，调整STS剂量为0、50、100、200、400、800 μmol/L，每个剂量设5个平行孔。分别置于常氧或低氧条件下培养48 h，弃上清，每孔加入100 μl CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h，用自动酶标仪测定450 nm的吸光度(OD)间接代表细胞数量。以常氧STS 0 μmol/L为对照孔，无细胞及STS的等量无血清DMEM培养基为空白孔，细胞增殖活力=[(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100%。

1.2.5 实时定量PCR检测促纤维化基因表达 将KFs传代接种于直径100 mm培养皿中，常氧条件下培养过夜，加入不同剂量STS(0、100、200 μmol/L)，再分别置于常氧和低氧下培养48 h后收集细胞。采用Trizol法(天根公司)提取总RNA，微量核苷酸测定仪测定浓度后用反转录试剂盒(Thermo公司)反转录cDNA。采用实时定量PCR进行基因扩增，以β-actin为内参基因，常氧下STS 0 μmol/L为对照组，用2-ΔΔCT法或2-ΔCT(cycle threshold，阈值循环数)计算待测基因的相对表达量，ΔCT=CT目的-CT内参，ΔΔCT=ΔCT实验组-ΔCT对照组。所用引物见表1。

表1 实时定量PCR引物序列

1.2.6 蛋白质印迹法(western blot)检测HIF-1α、TGF-β1蛋白表达 组别设置同mRNA基因检测，收集细胞后提取细胞总蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定蛋白浓度。按常规方法进行电泳和转膜，电泳上样量为60 μg，用5% BSA封闭1 h，一抗(TGF-β1、HIF-1α 1∶1000，β-actin 1∶500)4 ℃孵育过夜，TBST液(Tris-Buffered Saline and Tween 20)洗膜后二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，TBST洗膜后用双色红外荧光成像系统采集图像。用Quantiy One图像分析系统获得条带的积分光密度(integral optical density，IOD)。以β-actin为内参蛋白，常氧下STS 0 μmol/L为对照组，目的蛋白相对表达量=(IOD实验组目的/IOD实验组内参)/(IOD对照组目的/IOD对照组内参)。

2 结果

2.1 STS对KFs形态学的影响

见图1。常氧与低氧条件下培养的KFs细胞生物形态学无明显差异。加入STS后，随着剂量的增加，细胞开始出现相应的形态学变化，主要表现为细胞生长变慢、突起变得更细长、间隙增宽，部分细胞体积增大，细胞轮廓变淡。当STS剂量达到800 μmol/L时，细胞折光性增高，贴壁细胞稀少，几乎不生长。常氧和低氧下STS对KFs形态学的影响镜下观察无明显差异。

图1 STS对KFs干预48 h后倒置相差显微镜下的细胞形态变化(×100) A：常氧条件；B：低氧条件；a：STS 0 μmol/L；b：STS 50 μmol/L；c：STS 100 μmol/L；d：STS 200 μmol/L；e：STS 400 μmol/L；f：STS 800 μmol/L

2.2 常氧和低氧下STS对KFs增殖的影响

见图2。KFs在常氧和低氧下培养48 h后其细胞增殖状况无显著差异。常氧下，STS从100至800 μmol/L对KFs的增殖均有明显抑制(P<0.01)。低氧下，STS的起效剂量高于常氧下，STS从200至800 μmol/L可见明显抑制增殖作用(P<0.01)。因此，后续实验在常氧和低氧下STS对KFs作用的剂量选用100及200 μmol/L。

图2 常氧和低氧下STS干预48 h后KFs细胞增殖活力的变化 **与常氧对照组比较，P<0.01；##与低氧对照组比较，P<0.01；n=5

2.3 常氧和低氧下STS对KFs促纤维化因子表达的影响

2.3.1 STS对HIF-1α mRNA及蛋白表达的影响见

表2。低氧培养48 h，低氧组HIF-1α相对常氧组表达增加，其中mRNA表达增加0.606(P=0.037)，蛋白表达增加0.950(P=0.002)。常氧下，STS组HIF-1α表达相对常氧组有增加的趋势，STS 200 μmol/L时，mRNA表达增加0.750(P=0.015)，其他的增加趋势无统计学意义(P>0.05)。低氧下，STS组HIF-1α的表达较低氧组则有下降的趋势，STS 200 μmol/L时mRNA表达降低0.548(P=0.016)，蛋白表达降低0.984(P=0.001)。

2.3.2 常氧和低氧下STS对TGF-β1 mRNA及蛋白表达的影响 见表2。相对常氧组，低氧下培养48 h低氧组TGF-β1 mRNA表达下降0.382(P=0.002)，蛋白表达增加1.641(P=0.011)。常氧下，STS抑制TGF-β1 mRNA表达，STS 200 μmol/L时表达下调0.349(P=0.007)； TGF-β1蛋白表达有增加趋势但无显著差异(P>0.05)。低氧下，STS对KFs的TGF-β1 mRNA及蛋白表达无明显影响(P>0.05)。

表2 常氧和低氧下STS对KFs细胞HIF-1α和TGF-β1表达的影响

各个因子的相对表达量均是相对其各自常氧组的表达量来表示。与常氧组比较*P<0.05，**P<0.01；与低氧组比较#P<0.01。HIF-1α mRNA的常氧+STS 100 μmol/L、常氧+STS 200 μmol/L、低氧+STS 200 μmol/L组n=4；其余各组n=5

2.3.3 常氧和低氧下STS对KFs细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达及其比值的影响 低氧培养48 h，与常氧组比较，低氧组Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达及其比值未见显著变化。常氧下，相对于常氧组，STS 100、200 μmol/L组的Ⅰ型胶原表达分别降低0.339(P=0.012)、0.320(P=0.006)，Ⅲ型胶原表达分别降低0.452(P=0.015)、0.453(P=0.015)；STS对Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的抑制未见明显剂量依赖性。低氧下，相对于低氧组，STS组的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达无显著变化(P>0.05)。无论是常氧还是低氧下，各组STS对KFs细胞的Ⅰ、Ⅲ型胶原比值均无明显影响(P>0.05)(表3)。

表3 在常氧和低氧下STS对Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

COL1A1、COL3A1的mRNA表达采用2-ΔΔCT进行计算，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值则采用2-ΔCT进行计算[8]。与常氧组比较*P<0.05，**P<0.01。n=5

2.3.4 常氧和低氧下STS对KFs细胞VEGF和Periostin mRNA表达的影响 见图3。低氧培养48 h，低氧组相对常氧组VEGF和Periostin的mRNA表达分别增加7.256(P=0.043)、6.285(P=0.006)。常氧下，STS 200 μmol/L组相对常氧组，Periostin mRNA表达增加8.553(P=0.000)。低氧下，STS 200 μmol/L组相对低氧组，Periostin表达减少2.139(P=0.310)，似乎有一定的抑制倾向。其他组STS对KFs的VEGF和Periostin mRNA表达未表现出显著作用(P>0.05)。

图3 常氧和低氧下STS对KFs细胞VEGF和Periostin mRNA表达的影响。A：VEGF的实时定量PCR结果，低氧组n=4，其余各组n=5。B：Periostin的实时定量PCR结果，n=5。与常氧组比较*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

瘢痕疙瘩是一种创伤后组织过度修复的表现。在研究创伤与瘢痕疙瘩形成的过程中，学者们观察到与瘢痕疙瘩形成相关的低氧微环境的存在[9]。研究表明，低氧微环境与KFs异常增殖及胶原合成、ECM重塑紊乱密切相关[10,11]。因此，寻找能够改善瘢痕组织低氧微环境、抑制KFs异常增殖及细胞外基质过度沉积药物，对治疗瘢痕疙瘩特别是有可能由低氧微环境引起的瘢痕疙瘩有着重要的意义。

活血化瘀类中药丹参及其有效成分具有明确的多种生物活性功能，包括抗氧化、抑制细胞增殖以及抗炎等，在瘢痕疙瘩等纤维化疾病的治疗方面得到越来越多的关注[12]。丹参的有效成分主要包括丹参酮和丹酚酸两大类化合物，本研究所用的STS属于丹参酮类化合物。丹参酮类化合物以改善血液循环、抗菌和抗炎[13]作用为主，另外还有抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、保护神经系统等作用[14]。本实验模拟体内缺氧病理微环境，观察常氧和低氧下STS对KFs增殖及促纤维化因子的影响，进一步研究丹参酮类化合物在治疗瘢痕疙瘩方面可能的作用。

常氧下，左强等[15]观察到丹参酮ⅡA能够抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖并诱导其凋STS亡。本实验观察到，常氧下和低氧下STS对瘢痕疙瘩细胞的增殖均具有抑制作用，而且存在剂量依赖性。另外，与常氧比较，低氧下STS抑制KFs增殖的起效剂量增高，同样剂量的STS对于KFs增殖抑制作用更小。常氧和低氧下STS对KFs作用的差异可能和KFs在低氧条件下细胞的增殖等功能状况改变有关。我们以前的研究[16]表明，在适度低氧条件下成纤维细胞增殖力增强。在本实验中也观察到KFs在低氧培养48 h，其HIF-1α和VEGF的表达明显上调，表明低氧环境确实影响了细胞的功能。细胞的功能状态直接影响其对STS的药物反应性。通过本实验观察到STS对KFs在常氧和低氧下的增殖抑制作用存在剂量差异，对于临床上STS的可能应用需要考虑瘢痕疙瘩病变组织是否存在低氧微环境酌情适当调整药物剂量。

在低氧微环境中，有研究表明KFs细胞能够上调HIF-1α调控相关信号通路产生适应性反应，使periostin、TGF-β1、VEGF、COL1、COL3等表达增加，KFs细胞增殖、迁移、侵袭、胶原分泌和Akt磷酸化水平均升高[16,17]，血管增殖[18]。本实验结果表明，STS能够显著抑制因低氧上调的HIF-1α表达，对受HIF-1α调控的、同样可被低氧上调的Periostin(瘢痕疙瘩过度增生的重要促进因子)也表现出一定的抑制倾向，表明STS可能可以通过抑制HIF-1α实现改善低氧微环境的作用。另外，在常氧下，我们却观察到STS能够促进HIF-1α和periostin表达，对此，目前还没有相关的报道，需要进一步的研究探讨。

转化生长因子β1(TGF-β1)是目前已知的与瘢痕疙瘩形成最为密切的细胞因子，它能够促进KFs细胞增殖和胶原等细胞外基质的形成，同时还可抑制蛋白酶和基质酶的活性，从而促进ECM的沉积[19]。抑制TGF-β1可以有效的治疗病理性瘢痕。本实验结果显示，常氧下STS能够抑制TGF-β1表达，随着TGF-β1 mRNA的下降，Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA也出现了下调；说明常氧下STS可以下调TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA，从而可能起到抑制瘢痕的作用。相关研究也有报道，黄芪和丹参提取物的混合物可以通过调节TGF/Smad信号通路抑制KFs的增殖、迁移和胶原分泌[20]。低氧培养48 h，我们观察到KFs的TGF-β1 mRNA出现下调，而STS对下调了的TGF-β1表达未见显著影响。有文献报道丹参酮的这一药理作用也并不明显，这可能是由于低氧刺激KFs的细胞生物学功能变化从而对STS不敏感所致。然而，这需要更多的实验研究证明。这也提示我们在用丹参等药物治疗瘢痕疙瘩时需考虑微环境在发病机制中的作用和相应的变化，以及这些变化对药物的药理作用的可能影响。

本实验结果说明，STS能够抑制KFs增殖和促纤维化因子的表达，其在瘢痕疙瘩的治疗方面具有良好的应用前景。

致谢：感谢北京大学第三医院中心实验室老师们对本课题所提供的技术支持和帮助。

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(修回日期：2015-05-07)

(责任编辑：王惠群)

Effects of Sodium Tanshinone ⅡA Sulfonate Under Hypoxia on Proliferation of Keloid Fibroblasts and Expression of Pro-Fibrogenic Factors

KangChunfu,ChenBin,QinZelian,etal.

DepartmentofPlasticSurgery,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100191,China

Correspondingauthor:QinZelian,E-mail:qinzl@bjmu.edu.cn

Objective To study the effects of sodium tanshinone ⅡA sulfonate (STS) under normoxia and hypoxia on proliferation of keloid fibroblasts (KFs) and expression of pro-fibrogenic factors, and to explore the potential therapeutic role of STS for keloid. Methods A total of 5 cases of KFs were cultured and then divided into different groups. The samples were treated with different doses of STS (0, 50, 100, 200, 400, and 800 μmol/L) for 48 h under normoxia (21% O2) or hypoxia (2% O2). The proliferation activity of KFs was detected with CCK-8 kit and the cell morphology was observed under inverted phase contrast microscope. After treatment of STS (0, 100, and 200 μmol/L, respectively), real time PCR assay was adopted to measure the mRNA expression of hypoxia inducible factor 1α (HIF-1α), transforming growth factor β1 (TGF-β1), collagen type Ⅰ (Col Ⅰ), collagen type Ⅲ (Col Ⅲ), vascular endothelial growth factor (VEGF), and periostin (PN). The protein expressions of HIF-1α and TGF-β1 were examined by western blot assay. Results The proliferation activity of KFs was not significantly different between normoxia and hypoxia. The STS inhibited the proliferation of KFs in a dose-dependent manner in normoxia and hypoxia (P<0.05). The minimal effective dose in hypoxia was higher than that in normoxia. Hypoxia for 48 h changed the expressions of pro-fibrogenic factors. The mRNA and protein expressions of HIF-1α were increased by 0.606 (P=0.037) and 0.950 (P=0.002), respectively. The mRNA expression of VEGF was increased by 7.256 (P=0.043). The mRNA expression of periostin was increased by 6.285 (P=0.006). The protein expression of TGF-β1 was increased by 1.641 (P=0.011). However, the STS did not significantly effected on the mRNA expressions of Col Ⅰ and Col Ⅲ. Treated with STS under normoxia for 48 h, the mRNA expressions of HIF-1α and periostin were increased by 0.750 (P=0.015) and 8.553 (P=0.000), respectively. The mRNA expressions of TGF-β1, Col Ⅰ, and Col Ⅲ were decreased by 0.349 (P=0.007), 0.320 (P=0.006), and 0.453 (P=0.015), respectively. There were not significant changes in the expressions of TGF-β1 protein and VEGF mRNA (P>0.05). Treated with STS under hypoxia for 48 h, the mRNA and protein levels of HIF-1α were decreased by 0.548 (P=0.016) and 0.984 (P=0.001), respectively. There were no significant changes in the mRNA levels of TGF-β1, Col Ⅰ, Col Ⅲ, VEGF,and periostin, as well as the protein level of TGF-β1. Conclusions The STS inhibits KFs proliferation in a dose-dependent manner and affects the expressions of pro-fibrogenic factors under both normoxia and hypoxia. The STS could be used as a candidate of therapeutic treatment against keloid.

Sodium tanshinone ⅡA sulfonate; Keloid fibroblast; Hypoxia; Proliferation; Gene expression

教育部博士点博导专项基金资助课题(20130001110095)

R619+.6

A

1009-6604(2015)07-0649-06

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.07.021

2015-04-27)

** 通讯作者，E-mail：qinzl@bjmu.edu.cn

① (北京大学第三医院中心实验室，北京 100191)

② (北京积水潭医院烧伤科，北京 100035)