靶向磁性纳米粒子用于急性颞叶癫痫的MRI 研究

付婷婷，孔庆霞，盛华强，高凌云

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，约30%为难治性癫痫，其中大多数为颞叶癫痫。手术成为治疗难治性癫痫的首选，其关键在于致痫灶的定位。美国癫痫协会和神经疾病及中风国家研究所认为AMT 是公认的癫痫替代标记物［1］，其在癫痫灶中具有高摄取的特点。Kaqawa 等［2］采用PET 技术发现在结节性硬化患儿致痫灶内，切除高AMT 代谢区后，可达到癫痫发作停止效果。本研究利用AMT 这一特性和超顺磁性纳米粒子的各种优势，将AMT 锚定到MNP 上形成靶向纳米探针，尝试对急性颞叶癫痫模型病灶的定位研究。

1 材料和方法

1.1 磁性纳米粒子 结构上我们遵循类似于Akhtari M［3］描述的制作纳米粒子的过程，使用核心为γ-Fe2O3 纳米晶体，外表为葡聚糖包被。使其平均直径约20 nm，并将浓度标定至2.4 mg Fe/ml。靶向纳米探针是在以上相同尺寸和表面的MNP 的基础上，通过磁性分离净化、洗涤、再分散而得，然后将AMT 与功能性的MNP 共价连接。螯合AMT 的MNP 由德国Micromod 公司提供。其浓度标定至2.4 mg Fe/ml，氨基酸密度5 nmol/mg Fe。

1.2 癫痫模型的建立及分组 实验动物健康雄性Sprague Dawley 大鼠50 只，体重200～250 g，由山东鲁抗实验动物中心提供(生产许可证scxk 鲁20130001)。将大鼠腹腔注射氯化锂(LiCl)127 mg/kg，18～20 h 后给予溴化甲基阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min 后腹腔注射匹罗卡品(Pilocarpine)30 mg/kg，给药后根据Racine 分级密切观察大鼠行为学改变评估癫痫发作程度。若注射匹罗卡品后30 min仍未出现IV～V 级痫性发作，则可补充少量的匹罗卡品，一般间隔10～15 min，每次剂量为10 mg/kg，最大追加剂量不得超过60 mg/kg。持续痫性发作(Racine 5 级以上)为成功模型，1 h 后，给予地西泮10 mg/kg 腹腔注射。如不能缓解痫性发作，可给予10%水合氯醛(0.3～0.4 ml/100 g)，直到痫性发作被解除，之后可给予腹腔注射葡萄糖给予能量支持。

造模成功且存活的45 只大鼠按照随机原则分为Saline 对照组(n=15)、P-MNP 对照组(n=15)、AMT-MNP 组(n=15)。对死亡的癫痫模型大鼠按随机抽样原则作及时补充。

Racine 行为学分级标准:0 级:精神状态良好、行为正常，无抽搐动作;Ⅰ级:头面部短暂、不自主抽动，如眨眼、须动、咀嚼等，伴有目光呆滞、眼球充血;Ⅱ级:全身不自主颤动、节律性点头，可伴有前肢抓挠动作;Ⅲ级:一侧前肢短暂性、局限性肌阵挛;Ⅳ级:双侧前肢阵挛、抬起，后肢直立;Ⅴ级:全面性强直-阵挛发作，因全身肌肉强直而站立，并失去体位控制、跌倒。

1.3 磁共振扫描动物研究 采用西门子3.0T超导型MR 扫描仪，配合使用3 英寸环形线圈。于癫痫模型癫痫大发作后的72 h 分别进行尾静脉注射AMT-MNP(15 mg/kg)、P-MNP(15 mg/kg)、生理盐水(等量)［4］。在注射前，注射后2～6 h 或24 h分别进行MR 扫描。扫描时用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，水平趴在线圈上方并固定，使线圈的中心与大鼠体部及磁场的中心保持一致。扫描序列为:T2sequences，2500TR/TE70，FOV 80 mm，层 厚2.0 mm，片层12，扫描时间6.50 min。癫痫灶横轴面T2驰豫时间数值测量采用T2map 序列，我们使用T2mapping 软件计算T2驰豫时间数值。

1.4 病理组织学检查

1.4.1 脑组织冰冻切片 MRI 后的SD 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。待麻醉后，仰卧固定、备皮，剪开胸腔并迅速将针头从左心尖插入，进入到升主动脉内，剪破右心耳，先用冷生理盐水快速灌注(约30 min)，再换成4%多聚甲醛灌流。灌注充分后断头取脑，将其浸到4%多聚甲醛中后固定，移入30%的蔗糖浸泡沉底，行与大脑MRI 时致癫灶位置吻合位置的冰冻连续冠状切片，切片厚5 μm，行组织病理学染色。

1.4.2 普鲁士蓝铁染色Perl's iron stain 将冰冻切片复温、凉干，蒸馏水冲洗3 min;入Perls stain，浸染15～30 min;蒸馏水2～5 min;入核固红染色液5～10 min;自来水冲洗1～5 s;常规脱水，二甲苯透明5 min，中性树胶封片，采用普通显微镜进行图像采集。

1.4.3 尼氏染色Nissl Staining 将冰冻切片复温、凉干;0.01 mol PBS 洗3 次;将切片置于水浴加热至60 ℃的0.5%甲苯胺蓝水溶液5～10 min，蒸馏水冲洗;70%酒精浸泡2 min，置于95%酒精中分色;置于100%酒精3 次，每次1 min;二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明各5 min，中性树胶封片，采用普通显微镜进行图像采集。

1.4.4 Fluoro-Jade B 染色 将冰冻切片复温、凉干;含1% NaOH 的80% 酒精溶液摇洗5 min;70%的酒精溶液浸泡2 min，蒸馏水2 min;0.06%高锰酸钾中震荡10 min，蒸馏水2 min;放入0.0004%的FJB 工作液，室温避光染色20 min，蒸馏水3 次，每次1 min;去除多余水分后，50 ℃～60 ℃烘烤15～30 min;浸入二甲苯透明2 min，用中性树胶封片，荧光显微镜下采用蓝色激发光(波长为450～490 nm)观察及图像采集。

1.5 统计学处理 本实验所有数据均采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。实验数据中，计量数据用均数±标准差()表示，组间比较用oneway ANOVA 分析，两两之间的比较使用LSD 检验。T2数值组内给药前后比较采用配对t 检验。P ＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癫痫模型磁共振扫描 T2序列结果显示病灶高信号，多位双侧，每只大鼠我们选择肉眼观察明显的一侧进行统计分析。给药前3 组之间的致痫灶T2值差异无显著性(P ＞0.05)。经注射后各组分别与给药前比较，Saline 组大鼠T2信号差异无显著性(P ＞0.05)，P-MNP 组致痫灶局部轻度变暗，T2值差异无显著性(P ＞0.05)，AMT-MNP 组致痫灶T2信号明显变暗，T2值显著下降，有统计学意义(P ＜0.05)(见表1、图1)。

2.2 普鲁士蓝染色观察铁粒子在大鼠脑内的分布 镜下可见，AMT-MNP 组和P-MNP 组脑组织内均有蓝棕色颗粒分布，与Saline 组比较有统计学意义(P ＜0.05)。其中AMT-MNP 组分布较多，有统计学意义(P ＜0.01)。发现铁颗粒多数分布在神经元细胞浆内，极少数分布在细胞周围。Saline 组未有蓝棕色颗粒分布(见表2、图2)。

2.3 尼氏染色观察模型大鼠海马神经元缺失镜下可见3 组海马CA3区海马神经元都出现尼氏染色着色浅，尼氏小体少，可见大量的异常形态的神经元，细胞体积变小，呈三角形或不规则形态，胞核与胞装分界不清，尼氏染色阳性细胞计数少;3 组在数量及形态上无明显差异，无统计学意义(P ＞0.05)(见表3)。

2.4 FJB 染色观察急性癫痫大鼠海马神经元损伤 镜下发现，3 组海马CA3区都出现大量FJB 阳性神经元，与尼氏染色的缺失部位相对应，CA1区的FJB阳性神经元相对较少。3 组比较FJB 阳性神经元数目差异无统计学意义(P ＞0.05)(见表4)。

表1 3 组癫痫模型大鼠MRI T2值变化()

表1 3 组癫痫模型大鼠MRI T2值变化()

给药前组间比较P ＞0.05;与给药前比较* P ＜0.05;与给药前比较#P ＞0.05

表2 3 组大鼠脑组织铁颗粒分布数目()

表2 3 组大鼠脑组织铁颗粒分布数目()

与Saline 组比较* P ＜0.05;与Saline 组比较#P ＜0.01;与PMNP 组比较ΔP ＜0.01

表3 尼氏染色各组大鼠海马CA3区神经元数目()

表3 尼氏染色各组大鼠海马CA3区神经元数目()

与Saline 组比较* P ＞0.05;与P-MNP 组比较#P ＞0.05

表4 FJB 染色各组大鼠海马CA3区FJB 阳性细胞数()

表4 FJB 染色各组大鼠海马CA3区FJB 阳性细胞数()

与Saline 组比较* P ＞0.05;与P-MNP 组比较#P ＞0.05

3 讨论

难治性颞叶癫痫的早期靶向定位与诊断是近年来癫痫领域研究的热点，是提高患者生存率、改善生活质量的关键所在。随着分子影像学的深入研究以及纳米粒子制备技术的不断发展，功能性MNP 在磁共振成像技术下进行病变部位的靶向检测已经深入神经系统疾病。我们设想通过匹罗卡品诱导颞叶癫痫模型，注射AMT-MNP 后经MRI 扫描，探讨其对于颞叶癫痫急性期致痫灶的靶向定位与早期诊断价值。我们发现功能性MNP 能够在癫痫大鼠MRI 上表现出特定的脑区域。影像学结合组织病理学证实，MNP 能够透过急性期癫痫模型大鼠BBB［5］。其原因可能是多方面的，首先，癫痫本身所致的炎症反应就会改变BBB 的功能，如破坏紧密连接的完整性，可增强血管内皮细胞胞饮作用等。Michalak Z等通过研究就发现癫痫持续状态后BBB 通透性增加［6］。其次，可能与MNP 本身特有的纳米效应(微小尺寸)有关。此外，MNP 的超顺磁性特性在MR中表现出的独特的功能也是原因之一。然而MNP能否通过正常脑组织BBB 仍需要进一步研究。本实验还发现注射AMT-MNP 后其可被脑实质摄取，并在致痫灶中呈现信号负增强。由于MNP 的超顺磁性在外加磁场的作用下，强烈地影响颗粒周围的水分子中氢质子的弛豫过程，同时能更为有效地缩短T2时间，因此超顺磁纳米颗粒使病灶表现出信号负增强变化［7］。我们比较了注射生理盐水、P-MNP和AMT-MNP 后对癫痫灶MRI 的强化效果，发现Saline 组致痫灶T2WI 信号无明显改变，而P-MNP 组和AMT-MNP 组有不同程度的下降。比较之下，AMT-MNP 组信号下降明显，表现出其对致痫灶的靶向性。原因是在癫痫病理情况下，AMT 通过犬尿氨酸路径代谢致使致痫灶高摄取AMT，从而提高了氧化铁纳米粒子的有效结合，使更多的铁颗粒滞留在致痫灶内。对于P-MNP 而言，致痫灶对其也有一定的结合和摄取，可能和癫痫中BBB 的通透性有所增加以及MNP 的超顺磁性有关。普鲁士蓝染色显示铁颗粒在与MRI 扫描相应的致痫灶中聚集，AMTMNP 组铁颗粒的聚集较P-MNP 组多，这就与MRI扫描T2WI 值的变化结果一致，进一步的支持我们的假设。尼氏染色和FJB 染色结果显示致痫灶中海马神经元的缺失情况，将3 组结果进行比较，发现注射功能性MNP 后，致痫灶神经元的病理变化并无显著改变，间接表明MNP 在脑组织内无明显毒性作用。关于这些粒子在人体内的新陈代谢，药理学研究表明这些MNP 的铁分子通过溶酶体溶解，葡聚糖则主要通过肾脏排泄［8］。Muldoon 等［9］则做了磁性纳米粒子的毒理学研究，发现这些粒子并未使动物脑细胞发生病理变化以及髓鞘的改变。我们相信随着纳米生物等技术的发展，MNP 必将会显示出更小的毒副作用从而为其临床应用奠定良好基础。综上所述，功能性的MNP 作为一种新型的MRI 对比剂，可以透过BBB 并在急性癫痫致痫灶内显像，AMTMNP 明显降低急性癫痫的MRI T2信号强度，起到了靶向定位致痫灶的作用，为靶向纳米探针可用于临床对疾病的定位、诊断及治疗奠定了基础。初步证实了功能性MNP 对脑组织无明显毒副作用，为临床应用提供了安全保障。但是本实验没有就纳米探针对缄默期及慢性期癫痫在MRI 的显像进行研究，而且本实验只是对少量样本进行研究，所以仍需要更深入的研究。

［1］Massoud A，Anatol B，Mark C，et al.Functionalized magnetonanoparticles for MRI diagnosis and localization in epilepsy［J］.Epilepsia，2008，49(8):1419-1430.

［2］Kaqawa K，Chuqani DC，Asano E，et al.Epilepsy surgery outcome in children with tuberous sclerosis complex evaluated with alpha-［11C］methyl-L-trypotophan position emission tomograpgy(PET)［J］.Child Neurol，2005，20(5):429-438.

［3］Akhtari M，Bragin A，Moats R，et al.Imaging brain neuronal activity using functionalized magnetonanoparticles and MRI［J］.Brain Topogr，2012，25(4):374-388.

［4］Dousset V，Gomez C，Petry KG，et al.Dose and scanning delay using USPIO for central nervous system macrophage imaging［J］.MAGMA，1999，8(3):185-189.

［5］Oby E，Janigro D.The blood-brain barrier and epilepsy［J］.Epilepsia，2006，47(11):1761-1774.

［6］Michalak Z，Sano T，Engel T，et al.Spatio-temporally restricted bloodbrain barrier disruption after intra-amy-gdala kainic acid-induced status epilepticus in mice［J］.Epilepsy Res，2013，103(2/3):167-179.

［7］Jun YW，Lee JH，Cheon J.Chemical design of nanoparticle probea for high-peformance magnetic resonance imaging［J］Angew Chem int Ed，2008，47(28):5122-5135.

［8］Islam T，Wolf G.The pharmacokinetics of the lymphotropic nanoparticle MRI contrast agent ferumoxtran-10［J］.Cancer Biomark，2009，5(2):69-73.

［9］Muldoon LL，Sandor M，Pinkston KE，et al.Imaging，distribution，and toxicity of Superparamagnetic iron oxide magnetic resonance nanoparticles in the rat brain and intracerebral tumor［J］.Neurosurgery，2005，57(4):785-796.

图1 急性期癫痫模型大鼠的磁共振T2加权图像

图2 各组急性癫痫模型大鼠普鲁士蓝染色情况