黄花菜多糖的提取工艺及含量测定

武永福

(陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳 745000)

通过水浴浸提法对黄花菜中的多糖物质进行提取，考察了提取温度、提取时间、料液比对多糖得率的影响，得出最佳提取工艺条件，用苯酚—硫酸法测定提取黄花菜的多糖，公式理论计算的多糖含量与提取的庆阳黄花菜多糖进行比较，求出用葡萄糖制作标准曲线时的换算因子，对传统的葡萄糖标准曲线法进行改进，从而使测定黄花菜中的多糖含量变得更为准确、方便［1-11］。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

黄花菜从甘肃省庆阳市购得。石油醚(天津富宇精细化工有限公司)、95%乙醇(西安三浦精细化工厂)、丙酮(西安化学试剂厂)、苯酚(天津红岩化学试剂厂)、浓硫酸(西安化学试剂厂)、葡萄糖(天津市新纯化学试剂研究所)，以上试剂均为分析纯，实验室用水为一次蒸馏水。

1.2 仪器

7230 可见分光光度计(上海精密科学仪器厂)、数字式恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)、电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)、电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、离心机(上海安亭科学仪器总厂)、循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 多糖含量测定［2-11］

苯酚—硫酸试剂与游离寡糖、己糖、糖醛酸起显色反应，己糖在490nm 处，戊糖及糖醛酸在480nm 有最大吸收，在一定范围内，吸光度值与糖含量呈线性关系，因此根据吸光度值可确定样品多糖含量。

(1)5%苯酚液配制:称取苯酚12.5g，置于250mL容量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，避光冷藏。

(2)标液配制:称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标品20mg，定容至500mL。

(3)标准曲线绘制:取标液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，用水补至1.0mL，加5%苯酚0.6mL，再加浓硫酸3.6mL，混匀，沸水加热30min，冷后490nm测吸光度，绘制葡萄糖糖标准曲线。

(4)样品多糖含量测定:移取20mL 多糖提取液，定容至250mL，按改良苯酚—硫酸法测吸光度，用标准曲线计算样品多糖含量。

(5)计算公式如(1)式:

(1)式中，X 为样品多糖含量(%);V 为标准曲线上葡萄糖体积数(mL);d 为稀释倍数;M 为黄花菜样品质量(mg)。

1.4 水浴法浸提黄花菜多糖［12-20］

1.4.1 水浴浸提工艺

原料→清洗→热风烘干→磨碎过筛→石油醚脱脂→水浴浸提3 次→过滤→合并滤液→旋转蒸发→加乙醇→离心→收集沉淀→加水复溶→加乙醇→离心→沉淀用无水乙醇或丙酮洗涤3 次→水浴干燥得黄花菜多糖晶体→称重。

1.4.2 操作要点［12-21］

(1)热风烘干:用烘箱在60℃对洗净的黄花菜烘干，直至黄花菜质量不再减轻为止。(2)磨碎过筛:过筛目数过高，会给以后的抽滤带来困难。(3)石油醚脱脂:索氏抽提回流至石油醚提取液无色为止。(4)加乙醇:加浓缩液5 倍体积的95%乙醇，静置过夜。(5)离心:用3 500 r/min，离心20min，取其上清液。(6)洗涤烘干称重:沉淀洗涤后所得多糖晶体在60～70℃烘箱干至质量不变，称重。

1.4.3 水浴浸提工艺条件正交设计优化

影响多糖得率的因素很多，主要因素有:浸提温度(A)、浸提时间(B)和料液比(C)，每因素取3 个水平，采用正交设计进行优化，详见三因素三水平正交试验表L9(33)。

1.4.4 换算因子的计算

将提出的黄花菜多糖进行准确称重，得到的重量与用苯酚—硫酸法测定出的多糖含量进行比较，计算出用葡萄糖标准曲线测定黄花菜多糖的换算因子。

计算公式如(2)式:

(2)式中，f:为换算因子;m 为提取出的黄花菜多糖质量(mg);M 为黄花菜样品的质量(mg);X 为样品中多糖的含量(%)［8-21］。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 料液比对样品多糖得率的影响

相同质量(5g)脱脂黄花菜，固定浸提温度60℃，浸提2h，浸提料液比分别取1∶10、1∶15、1∶20、1∶30，测其吸光度，结果见图1。

图1 液料比对黄花菜多糖得率的影响

由图1 可知，料液比低于1∶15 时提取率随料液比的增大而明显增加;当料液比大于1∶15 时提取率随着料液比的增大而稍减少。所以，本次试验选取1∶15 的料液比较为合适。

2.1.2 提取时间对黄花菜多糖得率的影响

分别取相同质量的黄花菜(5g)，固定提取温度60℃、料液比为1∶15，浸提时间分别取2、4、6、8h，测其提取率，结果见图2。

图2 浸提时间对提取率得的影响

由图2 可以看出，时间在2～4h 内，黄花菜多糖提取率增长较快;在4～8h 内，提取率人有提高，但增幅较小，提高并不显著，从生产成本上考虑，选取6h 的提取时间较为合理。

2.1.3 提取温度对黄花菜多糖提取率的影响

分别取相同质量的黄花菜(5g)，固定提取时间4h、料液比1∶15，浸提温度分别为60、70、80、90℃，测其提取率，其结果见图3。

图3 浸提温度对多糖得率的影响

由图3 可知，在70～90℃间，提取率随浸提温度升高而增加，但提取率增加不显著，从生产成本角度考虑，浸提温度80℃较合理。

2.2 热水提取最佳工艺条件确定

正交设计因素水平见表4。

表4 正交设计因素水平

由正交设计试验结果可知，影响多糖得率的诸因素的主次关系依次是提取温度(A)、提取时间(B)、料液比(C)。最佳组合为A3B3C3，即提取温度80℃、浸提时间6h、料液比1∶15 时，提取的黄花菜多糖液的吸光度为2.566 (表5)。

2.3 用苯酚一硫酸法测定黄花菜多糖含量

由表6 可得，回归方程为:y=0.468x +0.083 5，R2=0.999 8。

表5 正交设计试验结果

表6 葡萄糖标准溶液浓度与吸光度的关系

根据正交试验结果，将采用最佳工艺条件A3B3C3提取的多糖滤液，采用苯酚—硫酸法测定其在490nm 处的吸光度，其吸光度为0.586，根据公式计算出黄花菜多糖的含量。

2.4 黄花菜多糖的提取

精确称取30g 黄花菜粉末，根据正交试验结果，确定提取温度为80℃、提取料液比为1∶15、提取时间6h。然后抽滤提取液，旋转蒸发浓缩，加约5 倍体积95%乙醇，静置过夜，沉淀过滤后60℃干燥，直到恒重为止，取出准确称重。

2.5 换算因子的计算

将提出的黄花菜多糖进行准确称重，得到3.3760g的黄花菜多糖，根据公式计算出换算因子为4.2。

3 结论

本试验中采取热水提取法对黄花菜多糖进行提取，通过单因素和正交试验找出了热水提取法在80℃，料液比为1∶15、浸提时间6h 时，浸提率最高。在此条件下求得黄花菜多糖含量为2.68%，并求得的苯酚硫酸法测定黄花菜多糖的换算因子为4.2。

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