鸡毒支原体SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

孙俊颖，刘志成，孙敏华，李冰玲，沈海燕，张春红，董嘉文，李林林，张建峰*

(1.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东广州 510640；2.广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640；3.广东省兽医公共卫生公共实验室，广东广州 510640；4.北京出入境检验检疫局，北京 100026)

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)是柔膜体纲，支原体目，支原体科的一类无细胞壁，能够自我复制的单细胞原核生物。基因组为双链环状DNA，仅0.9～1.2×106bp，G+C 含量低。MG 感染引起的禽慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease，CRD)广泛分布所有养禽国家，在我国部分地区感染率高达75 %以上。该病可以通过水平和垂直方式传播，并可以引起继发感染，严重阻碍养禽业的健康发展。控制MG 感染的最根本有效方法是对感染鸡群进行净化，从根本上防止MG 的传播和流行。但由于经济原因，大多数鸡场仍采用疫苗防控[1]。因此，建立一种敏感性高、特异性强、快速有效的检测方法对鸡群的早期诊断和净化，以及对疫苗质量的监控和分子流行病学调查都具有重要意义。

目前MG 的检测常采用血清学方法，如ELISA、血清平板凝集(SPA)、血凝抑制试验(HI)作为鸡群筛查方法[2]，采用病原分离培养和PCR 方法作为确证方法[3]。现有检测方法各有优点，但存在灵敏度低，存在交叉反应，培养周期长或样品易污染等方面不足。荧光定量PCR 方法采用荧光信号，极大提高检测的灵敏性，同时可以定量检测，并且能够避免常规PCR 电泳检测所带来的高污染率，成为病原检测的重要技术。本研究以MG 16S rDNA 基因为靶标，建立了MG 的荧光定量PCR 检测方法，显著提高了MG 检测的敏感性和特异性，为病原早期诊断和疫苗定量监测提供了有效手段。

1 材料和方法

1.1 菌株、病毒及临床样品 MG S6 株由中国农业大学兽医药理实验室惠赠；MG Ts-11 疫苗购自澳大利亚生物制品有限公司；MG 6/85 疫苗购自美国英特威公司；MG F36 疫苗购自广东永顺生物制药公司；鸡滑液支原体(M.synoviae，MS)、猪肺炎支原体(M.pneumonia of swine，MPs)、鸡传染性喉气管炎病毒(ALTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)及鸡新城疫病毒(NDV)均由本实验室分离和保存；临床样品来源广东粤西地区4 市(湛江、茂名、阳江、云浮)鸡场疑似病料。

1.2 主要试剂 核酸抽提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒和质粒抽提试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；pMD18-T 载体和SYBR Premix Ex Taq 均购自TaKaRa 公司。

1.3 引物设计与合成 对GenBank 中登录的不同国家和地区MG 16S rDNA 基因的序列进行比对，根据其保守区域设计一对特异性引物：5'-AGCTAA TCTGTAAAGTTGGTC-3'/5'-CGCTTCCTTGCGGTTA GCAAC-3'，预期扩增片段大小为186 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 荧光定量PCR重组质粒标准品的制备 按照DNA 提取试剂盒说明提取MG S6 株DNA，以其为模板利用引物F/R 进行PCR 扩增，扩增产物经胶回收纯化后，克隆于pMD18-T 载体中构建重组质粒，测定其浓度并计算拷贝数[4]后作为荧光定量PCR 的标准标准品。

1.5 反应条件的优化及标准曲线的建立 应用矩阵法对荧光定量PCR 的引物浓度(0.1 μM、0.3 μM、0.5 μM、0.7 μM)、退火温度(51 ℃、53 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃)等进行优化，以得到最佳反应条件。

将重组质粒标准品10 倍梯度稀释至浓度范围为1.96×108拷贝/μL～1.96×102拷贝/μL。以各浓度梯度的质粒DNA 为模板，采用建立的荧光定量PCR进行扩增，绘制动力学曲线，并通过仪器软件自动生成标准曲线。

1.6 特异性试验 以MG S6、MG Ts-11、MS、MPs、ALTV、NDV、AIV、IBV 的DNA 为模板进行荧光定量PCR 反应，以验证该方法的特异性。

1.7 敏感性试验 将重组质粒标准品10 倍梯度稀释至1.96×101拷贝/μL，以每个稀释度的标准品为模板，进行荧光定量PCR 扩增，以确定最低检测限。判定标准为Ct 值在35 个循环以内的判定为阳性扩增，Ct 值高于35 个循环的判定为阴性扩增，同时进行普通PCR 扩增作为对照，比较两者敏感性。

1.8 重复性试验 选取1.96×106拷贝/μL、1.96×104拷贝/μL、1.96×102拷贝/μL 3 个稀释度标准品作为模板进行批内和批间重复性试验。每个稀释度重复检测3 次。根据循环阈值的差异计算批内和批间变异系数。

1.9 临床样本和疫苗检测 采集30 份来自广东不同地区的疑似鸡慢性呼吸道病病料样本，提取核酸，分别进行荧光定量PCR、常规PCR 和SPA 检测，以比较3 种方法的灵敏度。将活疫苗用PBS 溶液溶解，取1 头份量稀释100 倍后，提取DNA，进行荧光定量PCR 试验，检测疫苗中病毒的含量。并对检测为阳性的样品进行测序验证。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的制备 重组质粒经PCR 鉴定和测序显示，PCR 产物约为186 bp，表明16S rDNA 片段已克隆至pMD18-T 载体中。重组质粒标准品浓度为62 ng/μL，根据公式计算分子拷贝数为1.96×1010拷贝/μL。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化 优化荧光定量PCR 反应体系为10 μL，其中SYBR Premix Ex Taq 5 μL，上下游引物(10 μM)各0.3 μL，模板1 μL，补加双蒸水至10 μL。优化荧光定量PCR 反应参数：95 ℃30 s；95 ℃5 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，在72 ℃采集荧光，共进行40 个循环；HRM 65 ℃～90 ℃。

2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 将重组质粒标准品10 倍倍比稀释后作为模板，采用优化的荧光定量PCR 条件进行扩增，以重组质粒拷贝数的常用对数值(lg copies)为x 轴，Ct 值为y 轴，得到标准曲线图(图1)，标准曲线方程为y=-3.24x+35.47，相关系数R2=0.999，结果呈良好线性关系。熔解曲线分析表明，其熔解温度为85 ℃～86 ℃，扩增的目的片段仅产生特异性单峰，无引物二聚体和非特异性扩增。

2.4 特异性试验 采用建立的荧光定量PCR 方法检测MG S6、MG Ts-11、MS、MPs、NDV、ILTV、AIV、IBV，结果显示仅MG 出现扩增曲线，其余均无阈值信号产生，表明建立方法特异性良好(图2)。

2.5 敏感性试验 对1.96×1010拷贝/μL～1.96×101拷贝/μL 10 个浓度的重组质粒标准品进行敏感性试验，结果显示，建立的荧光定量PCR 方法对重组质粒标准品的检测下限为1.96×101拷贝/μL，而常规PCR 的检测下限为1.96×103拷贝/μL(图3)，表明荧光定量PCR 比常规PCR 的敏感性高100 倍。

图1 荧光定量PCR 标准曲线和熔解曲线Fig.1 Standard curve and melting curve of SYBR Green I real-time PCR for detection of recombinant plasmids with series dilutions

图2 MG 荧光定量PCR 的特异性扩增曲线Fig.2 The specific amplification curve of SYBR Green I real-time PCR for detection of MG

图3 MG 荧光定量PCR 和常规PCR 敏感性试验比较Fig.3 Sensitivity test comparision of SYBR I Green real-time PCR and conventional PCR for MG

2.6 重复性试验 采用建立的荧光定量PCR 方法对1.96×106拷贝/μL、1.96×104拷贝/μL、1.96×102拷贝/μL 的标准品做3 次重复检测，批间和批内的变异系数均小于2 %(表1)，表明该方法具有良好的重复性。

表1 荧光定量PCR 重复性试验结果Table 1 The reproducibility test of the SYBR I Green real-time PCR

2.7 临床样品的检测 抽检来自粤西4 市鸡场呼吸道病的肺脏样品30 份，利用建立的荧光定量PCR、常规PCR 及SPA 方法对病料样品进行检测。结果显示，在30 份待检样品中，荧光定量PCR 检出12份阳性，常规PCR 检出10 份阳性，SPA 检出7 份阳性(表2)。表明本实验建立的荧光定量PCR 的敏感性显著高于常规PCR 及血清学方法。采用荧光定量PCR 方法对活疫苗检测的结果每头份为2.0×107拷贝/μL。

表2 临床样品检测结果Table 2 Detection results of clinical samples

3 讨论

目前MG 的检测方法主要有血清学方法、分离培养法、分子生物学方法等。血清学方法，如ELISA 及胶体金技术、SPA、HI 等临床常用的检测方法[5-7]，广泛应用于养禽场筛选试验，但很难检测出早期的MG 感染，并且敏感性低。病原分离培养仍是病原检测的金标准，但MG 病原生长条件苛刻，培养周期长(7 d～10 d)，给分离培养带来严重挑战，而且MG 常伴发有混合感染，也增加了MG分离的难度，不适用于早期诊断。PCR 方法敏感性高，特异性强，是目前MG 最常采用的分子生物学检测方法，一些学者建立了以mgc2、16S rRNA、LP、gapA 基因为靶标的PCR 检测方法[8-11]。近年来开始利用荧光定量PCR 技术检测MG。Kahya 和周云蕾等分别以mgc 基因和PvpA 基因为靶基因序列建立了荧光定量PCR 方法，检测限分别为0.9 pg/μL和72 拷贝/反应[7-12]；Fraga 建立了能够同时区分MG 和MS 的Taq man 荧光定量PCR 方法，对MG的检测限为25 拷贝/反应，定量限为102拷贝/反应[13]；本研究以16S rDNA 为靶标建立了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法，检测限为19.6 拷贝/μL(19.6 拷贝/反应)。

在疫苗的质量监控中，病毒含量是至关重要的，建立简便、快速、可靠的病原检测方法对疫苗生产的监控具有实际意义。目前主要是通过活菌计数方法来检测MG 疫苗中的病原含量，但活菌计数方法操作繁琐，所需时间长，不能达到实时监控，误差也较大。本实验采用荧光定量PCR 对F36 株弱毒疫苗的病毒含量进行了测定，结果测得每头份MG 的含量为2.0×107拷贝/μL。该方法的建立为弱毒疫苗的质量监控提供了一种新的快速检测方法。

综上所述，本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法特异性高，重复性好，灵敏度比常规PCR 高100 倍，并且可避免常规PCR 电泳检测所带来的高污染率，在敏感性和检测速度上有明显提高，并且可精确定量，可应用于MG 感染引起的慢性呼吸道病的早期检测及疫苗监测等方面的定量研究。

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