非洲猪瘟病毒P30蛋白在昆虫细胞中的表达

李 林，任炜杰，邹艳丽，吴晓东，刘 珊，张永强，刘春菊，王志亮

(中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心，山东青岛 266032)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由ASF 病毒(ASFV)引起的一种家猪和野猪急性、高度传染性疾病[1]。ASFV 是目前已知唯一的DNA 虫媒病毒，仅有一个血清型，但存在多种有毒力差别的病毒株。ASFV 的基因组为双链DNA，大小170 kb～190 kb。目前尚无有效的ASF 疫苗，控制该病只能依赖于可靠的监测计划、扑杀感染猪和其他控制措施。由于天然弱毒株的存在，一些感染条件可能导致降低死亡率，在这些情况下，可以采用检测特异性抗体对该病进行诊断。尽管现在已经建立了荧光定量PCR方法检测感染动物中的ASFV[2]，但ASFV 特异性抗体检测仍然是诊断和控制该病的主要工具。ASFV抗体检测技术已经成为亚急性、慢性或亚临床感染动物诊断的公认方法[3]。目前具有诊断意义的病毒基因及其编码蛋白主要有：B646L(P72 蛋白)、E183L(P54 蛋白)、CP204L(P30 蛋白)和CP530(PP62蛋白)等[3-5]。ASFV 的P30 蛋白由CP204L 基因编码，是ASFV 的重要结构蛋白之一，为病毒的早期蛋白，在感染后4 h 胞浆内即可检测到[6]，针对该蛋白已经建立了多种检测技术如ELISA、免疫印迹检测抗体[7]。

我国还未发现ASF，但该病一旦传入将对我国养殖行业造成严重的损失，因此国内急需建立该病的快速检测技术。本研究采用重组杆状病毒表达ASF VP30 蛋白，并鉴定了其抗原性和在ELISA 中的反应原性，为ASFV 抗体ELISA 检测方法的建立奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒核酸、细胞及血清 ASFV 格鲁吉亚株CP204L 基因参照GenBank 中的序列(FR682468)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Sf9 细胞购自Life Technologies 公司；ASFV 标准阳性及阴性血清购置西班牙INGENASA 公司；猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)和猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清均由本实验室制备和保存。

1.2 主要试剂 Phusion 超保真PCR 试剂盒、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶和蛋白质Marker 购自NEB 公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN 公司；抗6×His 单克隆抗体(MAb)、HRP标记的兔抗鼠IgG(IgG-HRP)和羊抗猪IgG-HRP 及二氨基联苯胺(DAB)购自Sigma 公司；His GraviTrap亲和柱购自GE Healthcare 公司；Lipofectin 转染试剂、Sf9 细胞培养基和NuPAGE 12 % Bis-Tris 预制胶购自Life Technologies 公司；PageRuler 预染色蛋白Marker 购自Thermo Scientific 公司；flashBAC 表达系统和pOET-1 质粒购自Oxford Expression Technology 公司。

1.3 引物的设计 根据GenBank 登录的ASFV 基因组序列(FR682468)中的CP204L 基因设计上下游引物P30F/P30R：5'-GGATCCCCGCGGATGGATTTTATTT TAAATATATCC-3'(SacⅡ)/5'-ATCCTTAATTAATTA GTGATGGTGATGGTGATGTTTTTTTTAAAAGTTTA ATAACCATG-3'(PacⅠ)，同时在下游引物的末端加入组氨酸标签，便于重组蛋白的纯化。

1.4 重组转移载体的构建 使用PCR 试剂盒和引物P30F/P30R 扩增P30 蛋白全长基因。将PCR 产物经SacⅡ/PacⅠ双酶切克隆至pOET-1 载体中，构建重组质粒pOET-P30，重新进行扩大培养后，提取质粒以供转染使用。

1.5 重组杆状病毒的制备及鉴定 参照Lipofectin转染试剂说明书步骤，将flash BAC DNA 和pOETP30 按照flash BAC 表达系统说明书制备P1 代重组病毒。将P1 代重组杆状病毒液接种Sf9 细胞进行重组病毒的扩增与传代，得到P2 和P3 代重组杆状病毒。提取P3 代杆状病毒DNA，以其为模板采用测序引物进行PCR 鉴定重组病毒DNA。

1.6 ASFV重组P30蛋白(rP30)的鉴定及纯化 将P3 代重组杆状病毒的上清液接种Sf9 细胞，27 ℃培养48 h，收集并裂解细胞后进行SDS-PAGE 电泳；采用半干法将电泳产物转印至硝酸纤维素膜上，以2%的BSA 封闭2 h，分别以抗6×His MAb(0.2 μg/mL)和ASFV 阳性血清(1∶200)为一抗，兔抗鼠IgG-HRP或羊抗猪IgG-HRP(1∶10 000)为二抗，DAB 显色，进行western blot 鉴定。并采用His GraviTrap 亲和柱按照产品说明书进行rP30 的纯化。

1.7 rP30的反应原性检测 rP30 纯化后，使用pH 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释成200 ng/mL 后包被ELISA板，50 μL/孔包被酶标板奇数条，pH 9.6 的碳酸盐缓冲液50 μL/孔直接包被酶标板偶数条，封闭后进行间接ELISA，其中对照血清及待检血清以1∶40 倍稀释，兔抗猪IgG-HRP 以1∶10 000 倍稀释，最后计算OD450nm值差=OD 样品奇数孔-OD 样品偶数孔。采用该方法对CSFV 阳性血清、PRRSV 阳性血清、猪FMDV 阳性血清、PRV 阳性血清、ASFV 标准阳性血清和ASFV 标准阴性进行检测。

2 结果与讨论

2.1 目的基因的扩增及重组质粒的构建 将PCR扩增后的p30 基因克隆至pOET-1 载体中构建重组质粒pOET-P30，经SacⅡ/PacⅠ双酶切、PCR 鉴定及测序鉴定显示，目的片段大小约为600 bp，与预期结果相符(图1)。

图1 p30 基因的扩增Fig.1 PCR product of p30 gene

2.2 表达rP30的重组杆状病毒制备 将重组质粒和flash BAC DNA 共转染Sf9 细胞，同时设立转移载体对照和细胞空白对照。72 h 后观察细胞病变情况。与空白对照细胞相比，产生重组杆状病毒的细胞中细胞数量明显减少，生长缓慢甚至停滞，病变细胞个体膨胀，体积变大，胞内有颗粒物形成，个别细胞破裂、裂解。

2.3 rP30表达的鉴定 收集接种P3 代重组杆状病毒72 h 后的细胞裂解产物和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，结果表明，在分子量约30 ku 处出现特异性条带，与预期相符，而正常细胞对照无此条带(图2A)。

图2 rP30 表达的SDS-PAGE(A)分析及western blot 的His MAb(B)和阳性血清(C)鉴定Fig.2 SDS-PAGE analysis(A)and identifications of the expressed rP30 protein by His MAb(B)and positive serum(C)

使用抗His 标签MAb 和ASF 阳性血清对重组蛋白western blot 检测表明，只有感染重组杆状病毒的细胞和纯化后的重组蛋白出现特异性条带，位置在约30 ku 处(图2B 和2C)，表明Sf9 细胞中表达的P30 蛋白能够被ASF 阳性血清识别。

2.4 rP30的反应性检测 根据公式：临界值=阴性样品的平均OD 值+3×标准偏差(SD)，确定临界值为0.2。以rP30 为包被抗原，采用间接ELISA 方法对CSFV、PRRSV、FMDV 和PRV 阳性血清进行检测，结果显示其临界值均小于0.2，检测结果为阴性，而与ASFV 标准阳性血清的反应结果呈阳性，与其它文献报道一致[8]。使用E.coli 表达的rP30 蛋白即使经过纯化，结果还是会带有很高的背景反应[9-10]。因此，在ELISA 中以杆状病毒表达的蛋白作为抗原可以减少假阳性，有利于更精确地诊断。

本研究中应用重组杆状病毒表达了ASFV 的P30 蛋白，并验证了其反应原性，为ASF 血清学检测技术的建立奠定了基础。

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