两株野鸟源H9N2亚型禽流感病毒的进化分析和对小鼠的感染性研究

肖 丽，崔鹏飞，张 芳，关立峥，施建忠，邓国华，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由A 型禽流感病毒(AIV)引起的禽类感染疾病综合症。AIV 的天然宿主为野鸟及水生鸟类，在家禽中，火鸡、鸡、鸭等也能够分离到AIV[1]。AIV 按照对鸡致病力高低分为高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)，而H9N2 亚型AIV 属于LPAIV。一般情况下H9N2在野鸟中呈现隐性感染过程，不表现明显临床症状，因此感染LPAIV 的野鸟可以长期携带病毒，并随其每年的迁徙而在不同国家间传播。Andrew 等也发现H9N2 能够通过野鸟在东亚和北美地区间传播[2]。

自1998 年以来，频繁有H9N2 亚型AIV 感染人类的报道[3]。在1997 年，香港暴发大量人感染H5N1 病例，经研究发现，分离到的H5N1 病毒与H9N2 的内部基因相似性在98 %～99 %，提示该H5N1 亚型AIV 与H9N2 亚型AIV 关系密切[4]。此外，2013 年人感染H7N9 和H10N8 病毒的内部基因与H9N2 亚型AIV 的内部基因高度同源。Matrosovich等发现，从香港活禽市场分离到的H9N2 亚型AIV具有α-2,6 受体结合特性，进一步证明其有感染人的能力[5]。禽源H9N2 AIV 与人源H3N2 AIV 在猪体内共存，为其基因重组提供了机会[6]。因此，对H9N2 亚型AIV 进行流行病学监测，了解其生物学特性具有重要的公共卫生意义。本研究室在2015 年从野鸟粪便中分离到两株H9N2 AIV，分别命名为Wild Bird/SC/S1264/2015(H9N2)和 Wild Bird/SC/S1411/2015(H9N2)，简称(WB/SC/264/15)和(WB/SC/411/15)。为了解这两分离株的遗传背景、与家禽H9N2 AIV 的相关性以及病毒对哺乳动物的感染性，本研究对这两株H9N2 AIV 进行了全基因组序列分析和小鼠感染性试验，为了解该亚型AIV 在国内的流行及其生物学特征提供了基础数据。

1 材料和方法

1.1 病毒及实验动物 两株H9N2 亚型AIV WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 由国家参考实验室分离并鉴定；SPF 鸡胚购自本研究所实验动物中心；BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.2 主要试剂 TRIzol 试剂和反转录酶(MLV)购自Invitrogen 公司；Taq DNA 聚合酶及DL2000 DNA Marker 等均购自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 购自Omega 公司；DNA 测序试剂盒购自Applied Biosystem 公司。

1.3 引物及参考序列 根据GenBank 中登录的各亚型基因节段序列选择同源性最高的区域设计引物；反转录通用引物序列：5'-AGCAAAAGCAG G-3'；所有扩增及测序引物均由国家禽流感参考实验室设计并保存。

1.4 病毒的增殖及鸡胚半数感染量(EID50)测定 将10 倍倍比稀释后的病毒接种9 日龄～11 日龄SPF鸡胚，纯化3 代后进行病毒增殖及保存；增殖后的H9N2 AIV 按10 倍倍比稀释，每个稀释度接种4 个9 日龄～11 日龄SPF 鸡胚，于37 ℃孵育48 h 后收集感染鸡胚尿囊液并测血凝价，根据Reed-Muench法计算病毒的EID50。

1.5 全基因组序列测定与分析 采用TRIzol 试剂提取病毒RNA，反转录制备cDNA 后，进行8 个基因片段的PCR 扩增，PCR 产物按照小量胶回收试剂盒的说明书的方法进行纯化，然后测序。所有序列通过MegAlian 软件、Mega 5 软件等进行分析。

1.6 BALB/c小鼠感染性试验 将病毒稀释至106EID50/0.05 mL，待小鼠轻微麻醉后，鼻腔接种0.05 mL的病毒稀释液。WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 分别接种8 只6 周龄的BALB/c 雌性小鼠，同时以等量的PBS 接种5 只小鼠作为阴性对照组。接种后3 d，每个感染组随机迫杀3 只小鼠，采集脑、鼻甲、脾、肺和肾脏进行病毒滴定。其余小鼠连续观察14 d，并记录每天的小鼠体重变化情况。

2 结果

2.1 序列进化分析 以提取的两个病毒分离株RNA 经反转录制备的cDNA 为模板，PCR 扩增其8个基因片段，然后测序。将WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 的全基因组序列在NCBI 上进行BLAST比对结果显示，各基因片段分别与H9N2、H7N9、H9N6、H6N2、H5N1 等多种亚型的AIV 高度同源(表1)。

2.1.1 HA 基因序列及进化分析 WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 的HA 基因的编码区均为1 683 nt，编码560 个氨基酸残基。氨基酸序列分析结果显示，两个分离株编码的HA 裂解位点基序均为333PSRSSR↓GL340，符合LPAIV 特征。而且，其HA蛋白受体结合位点处的第226 位及228 位分别为谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，具有结合禽源AIV 受体的分子特征。WB/SC/264/15 的HA 具有7 个潜在糖基化位点，分别为29NST31、141NVS143、298NTT300、305NVS307、313NCS315、492NGT494及551NGS553。由于WB/SC/411/15 的HA 蛋白中第220 位氨基酸残基为异亮氨酸(I)，导致其HA 蛋白比WB/SC/264/15 多一个糖基化位点，即218NRT220。两个分离株的HA 基因同属于Beijing/1/94-like 分支，核苷酸同源性为94.3 %(图1)。

表1 两个分离株全基因组序列Blast 分析结果Table 1 The blast analysis of genes of WB/SC/264/15 and WB/SC/411/15

图1 HA 基因进化树Fig.1 Phyogenetic tree based on HA gene

2.1.2 NA 基因序列及进化分析 WB/SC/264/15 和WB/SC/411/15 的NA 基因编码区长度均为1 401 nt，无颈部缺失，共编码466 个氨基酸，核苷酸同源性为98.1 %。均具有7 个潜在糖基化位点，分别为66NST68、83NWS85、143NST145、197NAT199、231NGT233、261NGT233、261NIS263和365NGS367。WB/SC/264/15 与A/pheasant/Hong Kong/NT279W/2009(H9N2)的NA 基因核苷酸同源性在97 %。而WB/SC/411/15 与A/Anser fabalis/China/HuBS428/2014(H9N2)的NA 基因核苷酸同源性在98 %。

2.1.3 内部基因序列及进化分析 内部基因序列分析显示，WB/SC/264/15 与A/tree sparrow/Shanghai/01/2013(H7N9)的M 基因核苷酸同源性高达99 %。而WB/SC/411/15 与一株人源H5N1 亚型AIV(A/Human/zhejiang/16/2006)的M 基因核苷酸同源性在95%。两个分离株的NS 蛋白颈部均未出现缺失。两个分离株的M、NP、NS、PA、PB1 和PB2 的核苷酸同源性分别为93.9 %、97.7 %、95.3 %、97.2 %、98.3 %和95.5 %。SC/264/15 和SC/411/15 的内部基因与H9N2、H7N9、H9N6、H6N2、H10N8、H10N6 和H5N1 等多种亚型的AIV 核苷酸同源性较高，表明内部基因来源复杂。

2.2 两个分离株对BALB/C小鼠的感染性试验 以106EID50的病毒量接种小鼠后，小鼠未出现明显的临床症状。在接种病毒后小鼠体重出现轻微下降，之后上升(图2)。在鼻腔接种病毒后的第3 d 每组随机迫杀3 只小鼠，采集脏器进行病毒滴定。脏器滴定结果显示，只在上呼吸道鼻甲中分离到病毒，而其他脏器滴定结果均呈阴性(图3)。

图2 小鼠感染病毒后体重变化情况Fig.2 Weight change of mice after inoculated with virus

3 讨论

图3 接种3 d 后BALB/c 小鼠脏器滴定结果Fig.3 Virus titer in BALB/c mouse organs on days 3 post inoculation

为了解H9N2 亚型AIV 的遗传进化特征以及对哺乳动物的潜在危害性，本研究对从野鸟粪便中分离到的两株H9N2 亚型AIV 进行全基因组序列和BALB/c 小鼠的感染性试验。小鼠感染性试验结果显示，两个分离株对小鼠呈低致病性特征，体重无明显变化，也未见明显的临床症状，脏器滴定结果显示病毒仅在小鼠上呼吸道鼻甲内有效复制，而近期张芳等分离的一株野鸟源的H9N2 亚型AIV 却不能在小鼠的任何脏器内复制[7]，表明野鸟源的H9N2亚型AIV 对小鼠的感染性也存在差异。另外，两个分离株的HA 蛋白第226 位及228 位分别为谷氨酰胺(Q)和甘氨酸(G)，倾向于结合禽源AIV 受体，也表明其感染哺乳动物的能力弱。目前国内H9N2 亚型AIV 的HA 蛋白的第226 位大多数为倾向结合人源受体的赖氨酸(L)，表明两个分离株来源可能比较原始。对两株H9N2 亚型AIV 进行遗传进化分析显示，各基因片段与H6N2、H7N9、H9N6、H9N2、H5N1 等多种亚型AIV 的核苷酸同源性均较高，表明不同亚型AIV 的内部基因重组现象明显。值得注意的是，WB/SC/411/15 与一株人源H5N1 亚型AIV(A/Human/zhejiang/16/2006)的M 基因核苷酸同源性在95 %，表明两者之间具有一定的进化关系。有研究表明，M 基因通常与HA 基因一起进行基因重组，而且M 基因是一个重要的宿主特异性决定性因素[8]。

迁徙鸟类为AIV 的自然宿主，而野生水禽为LPAIV 的主要自然宿主[9]。LPAIV 最早是从钻水鸭中分离到的，一些野鸟之前接触过LPAIV，如H9N2 亚型AIV 后，从而可能获得了对H5N1 亚型AIV 的部分免疫功能[10]。近期，有研究表明野鸟在H5N8 亚型AIV 由亚洲向欧洲、美洲等地的传播过程中发挥着重要的作用[11-12]。因此，对野鸟，尤其是水禽的AIV 携带情况的生物学监测是至关重要的。

[1]Nicholson K G,Wood J M,Zambon M.Influenza[J].Lancet,2003,362(9397):1733-1745.

[2]Ramey A M,Reeves A B,Sonsthagen S A,et al.Dispersal of H9N2 influenza A viruses between East Asia and North America by wild birds[J].Virology,2015,482:79-83.

[3]Butt K M,Smith G J,Chen,Huanle,et al.Human infection with an avian H9N2 influenza A virus in Hong Kong in 2003[J].J Clin Microbiol,2005,43(11):5760-5767.

[4]Lin Yu-ping,Shaw M,Gregory V,et al.Avian-to-human transmission of H9N2 subtype influenza A viruses:relationship between H9N2 and H5N1 human isolates[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(17):9654-9658.

[5]Matrosovich M N,Krauss S,Webster R G.H9N2 influenza A viruses from poultry in Asia have human virus-like receptor specificity[J].Virology,2001,281(2):156-162.

[6]Peiris J S,Guan Y,Markwell D,et al.Cocirculation of avian H9N2 and contemporary "human" H3N2 influenza A viruses in pigs in southeastern China:potential for genetic reassortment?[J].J Virol,2001,75(20):9679-9686.

[7]张芳，王晶，卢昆鹏，等.一株野鸟源H9N2 亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及致病性研究[J].中国预防兽医学报，2015，37(01)：15-18.

[8]Scholtissek C,Stech J,Krauss S,et al.Cooperation between the hemagglutinin of avian viruses and the matrix protein of human influenza A viruses[J].J Virol,2002,76(4):1781-1786.

[9]Olsen B,Munster V J,Wallensten A,et al.Global patterns of influenza a virus in wild birds[J].Science,2006,312(5772):384-388.

[10]Khalenkov A,Perk S,Panshin A,et al.Modulation of the severity of highly pathogenic H5N1 influenza in chickens previously inoculated with Israeli H9N2 influenza viruses[J].Virology,2009,383(1):32-38.

[11]Lee D H,Torchetti M K,Winker K,et al.Intercontinental spread of Asian-origin H5N8 to North America through Beringia by migratory birds[J].J Virol,2015,89(12):6521-6524.

[12]Dalby A R,Iqbal M.The European and Japanese outbreaks of H5N8 derive from a single source population providing evidence for the dispersal along the long distance bird migratory flyways[J].Peer J,2015,3:e934.