老龙七水提液对兔离体肠平滑肌收缩的影响Δ

李志东，王 慧，张海娟，陈现伟，胡开良，刘旭海，冯尚彩#（1.广州中医药大学研究生院，广州 510006；.临沂大学山东省鲁南中药材资源开发工程技术研究中心，山东临沂 76000；.临沂市人民医院，山东临沂 7600）

地衣药用在我国《本草纲目》与民间医药书籍中早有记载[1]，《陕西七药》记载的137 种七药来源于54 科114 属的153 种药用植物，其中地衣类3属5种[2]。老龙七为陕西七药的一种，亦称蛤蟆七、老龙皮、石龙衣等，为肺衣科（Lobariaceae）肺衣属（Lobaria）植物光肺衣（Lobaria kurokawae Yoshim）的干燥全草，主治消化不良、肾炎水肿等症[1，3-4]。

近年来，对老龙七提取物的药理活性研究主要集中于抗炎、抑菌、抗氧化等活性研究方面[5-7]；对老龙七的化学成分研究表明，其主要的次级代谢产物为三萜酸类化合物[8-9]，具有抗菌、抗癌等活性[10-11]。老龙七在陕西秦岭山区主要用于治疗消化不良、肾炎水肿等症，但对消化系统疾病的作用机制研究尚未见报道。本研究拟以兔离体小肠为研究对象，探讨老龙七水提液对兔离体肠平滑肌收缩的影响及其作用机制，为该药的药效学研究和临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

恒温水浴锅、BL-420E 型生物机能实验系统、HW-400S 型恒温平滑肌浴槽、FT-100型生物张力传感器（成都泰盟科技有限公司）；GR-202 型电子分析天平（日本AND 公司）；移液器（德国Eppendorf公司）。

1.2 药材

老龙七药材购自汉方养生堂有限公司（批号：130111，产地：陕西），由泰山医学院孙丽彦副教授鉴定为真品。标本保存在临沂大学现代药物研究院（No.2013sx0801）。

1.3 药品与试剂

氯化乙酰胆碱（美国Alfa Aesar 公司，批号：10129040，纯度：98%）；盐酸阿托品注射液（山东华信制药集团股份有限公司，批号：13041401，规格：10 mg×2 ml）；试验所用试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

1.4 动物

2 方法

2.1 台氏液的配制

取NaCl 8 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.26 g、NaH2PO4·2H2O 0.065 g、NaHCO31 g、CaCl20.2 g、葡萄糖1 g，先将CaCl2用蒸馏水溶解完全，再加入其余6种物质溶解，转移至1 000 ml量瓶中，蒸馏水定容。

2.2 供试液的制备

准确称取老龙七药材10.0 g，以蒸馏水提取2次，2次加水量均为400 ml，水沸后煎煮时间依次为30、20 min；2次煎液合并，浓缩并定容至50 ml，即得老龙七水提液[质量浓度为200 g（生药）/L]。制备氯化乙酰胆碱、盐酸阿托品溶液质量浓度分别为0.1、0.5 g/L。需稀释的供试液均以台氏液稀释。

2.3 离体肠的制备[12-13]

取健康大白兔，禁食24 h，不禁水。用槌猛击其后枕部，使其暴死，迅速打开腹腔，以胃幽门与十二指肠交界处为起点剪取肠管，立即置于盛有混合气体（95%O2和5%CO2）的饱和台氏液中，洗去内容物，剪成1.5～2.0 cm 左右，每只兔选择较有规律的3段肠管进行试验。

2.4 老龙七水提液对兔离体肠平滑肌收缩的影响

打开BL-420E型生物机能实验系统，调零，定标，在“通道一”输入接口处安装张力换能器。调节恒温平滑肌槽，使水温保持在（37±0.5）℃，将台式液加入预管内，药物管加入16 ml台氏液。取一肠段，上端连接张力换能器，下端连于L型通气钩上，将肠管放入药物管并固定，调节恒温平滑肌槽，通入混合气95%O2和5%CO2，标准负荷1 g，平衡30 min，待肠管收缩稳定后，加药[14]。

试验分为3 组，即对照（等容台氏液）组与老龙七水提液①、②、③、④、⑤[0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 g（生药）/L]组，每组取6肠段。先描记肠管的正常运动曲线，然后用移液器向平滑肌槽中加入相应药物，给药前后5 min，分别记录肠管的运动波形。记录兔离体肠平滑肌收缩频率、振幅和张力，以上述3指标为收缩效果指标。每次给药完成后，立即用预热的台氏液冲洗肠管至少3次，待肠管恢复收缩后，再进行下一次给药[12]。

2.5 老龙七水提液对乙酰胆碱诱导下兔离体肠平滑肌收缩的影响

在正常台氏液条件下，待肠平滑肌收缩稳定后，加入终质量浓度为0.003 125 g/L 的乙酰胆碱，持续一定时间，待肠平滑肌振幅无变化后再加入质量浓度为1.25 g（生药）/L的老龙七水提液。试验分为3 组，即对照（等容台氏液）组、乙酰胆碱（0.003 125 g/L）组与老龙七水提液[乙酰胆碱0.003 125 g/L+老龙七水提液1.25 g（生药）/L]组。记录兔离体肠平滑肌收缩频率、振幅和张力。

2.6 老龙七水提液对阿托品诱导下兔离体肠平滑肌收缩的影响

在正常台氏液条件下，待肠平滑肌收缩稳定后，加入终质量浓度为0.003 125 g/L的阿托品，持续一定时间，待肠平滑肌振幅无变化后再加入质量浓度为1.25 g（生药）/L 的老龙七水提液。试验分为3组，即对照（等容台氏液）组、阿托品（0.003 125 g/L）组与老龙七水提液[阿托品0.003 125 g/L+老龙七水提液1.25 g（生药）/L]组。记录兔离体肠平滑肌收缩频率、振幅和张力。

2.7 统计学方法[12-14]

3 结果

3.1 老龙七水提液对兔离体肠平滑肌收缩的影响

与对照组比较，老龙七水提液①、②、③、④、⑤组兔离体肠平滑肌收缩频率差异无统计学意义（P＞0.05）；老龙七水提液③、④、⑤组兔离体肠平滑肌振幅增大，差异有统计学意义（P＜0.01），老龙七水提液②、③、④、⑤组兔离体肠平滑肌张力增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。结果表明，在0.25～1.25 g（生药）/L质量浓度范围内，兔离体肠平滑肌收缩频率变化不大，但随着质量浓度的增加兔离体肠平滑肌振幅与张力也逐渐加大。不同质量浓度老龙七水提液对兔离体肠平滑肌运动波形的影响见图1；老龙七水提液对兔离体肠平滑肌收缩频率、振幅与张力的影响见表1。

图1 不同质量浓度老龙七水提液对兔离体肠平滑肌运动波形的影响Fig 1 Effects of water extract with different concentrations of L.retigera on smooth muscle movement wave form

表1 老龙七水提液对兔离体肠平滑肌收缩频率、振幅与张力的影响（，n＝6）Tab 1 Effects of L.retigera water extract on the frequency，amplitude and contractive tension of intestinal muscle spontaneous contractions（，n＝6）

表1 老龙七水提液对兔离体肠平滑肌收缩频率、振幅与张力的影响（，n＝6）Tab 1 Effects of L.retigera water extract on the frequency，amplitude and contractive tension of intestinal muscle spontaneous contractions（，n＝6）

注：与对照组比较，＊P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01

3.2 老龙七水提液对乙酰胆碱诱导的兔离体肠平滑肌收缩的影响

各组间兔离体肠平滑肌收缩频率差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组比较，乙酰胆碱组兔离体肠平滑肌振幅、张力增大，差异有统计学意义（P＜0.01 或P＜0.05）。与乙酰胆碱组比较，老龙七水提液组兔离体平滑肌振幅、张力增大，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，1.25 g（生药）/L 老龙七水提液对乙酰胆碱的收缩兔离体肠平滑肌作用有刺激性。老龙七水提液对乙酰胆碱诱导下的兔离体肠平滑肌运动波形的影响见图2；老龙七水提液对乙酰胆碱引起的兔离体肠收缩频率、振幅与张力的影响见表2。

图2 老龙七水提液对乙酰胆碱诱导下兔离体肠平滑肌运动波形的影响Fig 2 Effects of water extract of L.retigera on acetylcholine-induced intestine smooth muscle movement wave form

3.3 老龙七水提液对阿托品诱导的兔离体肠平滑肌舒张作用的影响

与对照组比较，阿托品组兔离体肠平滑肌频率降低，振幅、张力减小，差异有统计学意义（P＜0.01）。与阿托品组比较，老龙七水提液组兔离体肠平滑肌频率差异无统计学意义（P＞0.05），振幅、张力增大，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，1.25 g（生药）/L老龙七水提液对阿托品舒张兔离体肠平滑肌有拮抗作用。老龙七水提液对阿托品诱导下兔离体肠平滑肌运动波形的影响见图3；老龙七水提液对阿托品诱导下兔离体肠平滑肌舒张频率、振幅与张力的影响见表3。

表2 老龙七水提液对乙酰胆碱诱导下兔离体肠平滑肌收缩频率、振幅与张力的影响（，n＝3）Tab 2 Effects of water extract of L.retigera on the frequency，amplitude and contractive tension of acetylcholine-induced intestinal muscle spontaneous contractions（，n＝3）

表2 老龙七水提液对乙酰胆碱诱导下兔离体肠平滑肌收缩频率、振幅与张力的影响（，n＝3）Tab 2 Effects of water extract of L.retigera on the frequency，amplitude and contractive tension of acetylcholine-induced intestinal muscle spontaneous contractions（，n＝3）

注：与对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与乙酰胆碱组比较，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.acetylcholine group，#P＜0.05

图3 老龙七水提液对阿托品诱导下兔离体肠平滑肌运动波形的影响Fig 3 Effects of water extract of L.retigera on atropine-induced intestinal smooth muscle movement wave form

表3 老龙七水提液对阿托品诱导下兔离体肠平滑肌舒张频率、振幅与张力的影响（，n＝3）Tab 3 Effects of water extract of L.retigera on the frequency，amplitude and relaxation tension of atropine-induced intestinal smooth muscle contractions（，n＝3）

表3 老龙七水提液对阿托品诱导下兔离体肠平滑肌舒张频率、振幅与张力的影响（，n＝3）Tab 3 Effects of water extract of L.retigera on the frequency，amplitude and relaxation tension of atropine-induced intestinal smooth muscle contractions（，n＝3）

注：与对照组比较，＊P＜0.01；与阿托品组比较，#P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.atropine group，#P＜0.05

4 讨论

老龙七为陕西七药的一种，为肺衣科肺衣属光肺衣植物的干燥全草。地衣类植物是菌藻共生体，其主要成分为地衣多糖和地衣酸[15]。老龙七水提液主要化学成分有地衣多糖、皂苷、鞣质、氨基酸、酚类以及部分有机酸等[7]，在陕西秦岭山区主要用于治疗消化不良、肾炎水肿等症。本研究结果显示，老龙七水提液对正常收缩条件下的兔离体肠平滑肌收缩振幅和张力有明显增强作用；对乙酰胆碱诱导的兔离体肠平滑肌的收缩具有协同作用；对阿托品诱导的兔离体肠平滑肌的舒张具有对抗作用。结果表明，老龙七水提液对兔离体肠平滑肌收缩具有明显增强作用，这一结果在一定程度上与其民间药用的作用是一致的，其作用机制可能与M受体兴奋性有关。

M受体广泛分布于全身各平滑肌组织中，包括胃肠道、子宫平滑肌等，其在维持全身平滑肌收缩状态时起主要作用[16]。乙酰胆碱为M 受体激动药，当乙酰胆碱与肠平滑肌上的乙酰胆碱受体结合位点结合后，引起M受体构象的转变，从而使乙酰胆碱受体偶联的离子通道开启，因胞内外存在的离子浓度差导致膜去极化，引起平滑肌细胞收缩[17]。阿托品作为M 受体拮抗药，具有解痉作用，可通过拮抗兔离体肠平滑肌上M受体使平滑肌舒张[18-19]。研究表明，老龙七提取液可明显增强乙酰胆碱诱导的M 受体的兴奋性，并拮抗M 受体拮抗药阿托品引起的舒张。这提示，老龙七对兔离体肠平滑肌收缩的激动作用可能与兴奋兔离体肠平滑肌上的M 受体有关；但其对兔离体肠平滑肌上的H1受体、钙离子通道等是否具有兴奋作用，尚需进一步研究。

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