正交试验优选黄芩苷血药浓度测定中大鼠血浆的处理条件Δ

李海龙，孙 妍，姚 琳，冯文成，胡 昊，王伟明（黑龙江省中医药科学院，哈尔滨 150036）

黄芩苷是黄芩的活性成分之一，有清热解毒、抑菌抗炎等功效[1]。因黄芩苷具有广泛的药理作用，所以一直有着良好的临床应用价值；但其脂溶性差，体内吸收率比较低，生物利用度差。因此，为了提高黄芩苷的生物利用度，黄芩苷的药动学研究一直是受到关注较多的课题[2]。作为中药复方拆方药动学的前期研究，本课题组通过对大鼠血浆中黄芩苷的处理方法进行研究，选出最优处理方法，为黄芩苷的药动学研究提供了处理方法依据。

1 材料

1.1 仪器

E2695型高效液相色谱（HPLC）仪、2489型紫外检测器（美国Waters公司）；BSA224S-CW型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；SK250H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；LG16-W 型高速台式离心机（北京京立离心机有限公司）；WH-3 微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器有限公司）；Milli-Q Reference System型超纯水器（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂

黄芩苷对照品（批号：110715-201016，纯度：≥98%）、芦丁对照品（批号：100080-200306，纯度：91%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，美国Dikma 公司）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 动物

2 方法与结果

2.1 色谱条件[3-4]

色谱柱：WATERS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.04%磷酸水溶液（38 ∶62，V/V），流速：1.0 ml/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。理论板数按黄芩苷计不少于3 000，黄芩苷与内标及其他杂质峰分离良好。

2.2 溶液的制备

精密称取黄芩苷对照品2.8 mg、芦丁对照品7.9 mg，分别置于25、50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，得质量浓度分别为112、158 μg/ml的黄芩苷、芦丁贮备溶液，4 ℃贮藏，备用。

2.3 血浆样品的采集

取Wistar 大鼠10 只，每只腹主动脉采血10 ml，置于肝素钠负压采血管中，以离心半径为4 cm、4 000 r/min离心15 min，分离血浆，置于－20 ℃贮藏，备用。

2.4 血浆样品的处理

于同一离心管中加入一定量的芦丁液（内标，158 μg/ml）、1 ml黄芩苷对照品溶液（112 μg/ml），氮气流下吹干，精密加入血浆样品200 μl混匀。按正交试验表进行血浆样品处理：加入磷酸、甲醇，涡旋，混合2 min，超声一定时间萃取，以离心半径为4 cm 第1 次离心一定时间（除蛋白沉淀），取上清液氮气流下吹干，加200 μl流动相复溶，涡旋混合1 min，以离心半径为3 cm 第2 次离心一定时间（除血浆中杂质）。每组3 个平行样品。处理完成后取上清液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，以测定量与加入量之比计算黄芩苷萃取回收率。

2.5 正交试验设计[5-9]

以黄芩苷萃取回收率为评价指标，以磷酸量（A）、甲醇量（B）、超声萃取时间（C）、离心转速1（D）、离心时间1（E）、离心转速2（F）、离心时间2（G）为考察因素，采用L18（37）正交表进行试验。因素与水平见表1；正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal test

由表2、表3 可知，各因素对试验结果的影响程度依次为A＞B＞G＞C＞E＞D＞F，血浆处理方法最优条件为A2B3C2D1E2F3G1，即加入磷酸50 μl、甲醇2 000 μl，涡旋混合2 min，超声萃取10 min，以离心半径为4 cm、3 000 r/min离心10min，取上清液于氮气流下吹干，取200 μl流动相复溶，涡旋混合1 min，以离心半径为3 cm、14 000 r/min 离心5 min。以极值最小的F因素为误差项进行方差分析，结果表明A、B、C、E、G，即加入磷酸量、甲醇量、超声萃取时间、离心时间对血浆中黄芩苷的萃取有显著影响，且A＞B＞G＞C＞E。

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

2.6 验证试验

为了确保提取工艺的重现性及可行性，于同一离心管中加入一定量的芦丁液（内标）、1 ml黄芩苷对照品溶液，氮气流下吹干，精密加入血浆样品200 μl混匀，平行5份，按血浆样品方法处理下最优条件操作，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算黄芩苷萃取回收率。结果，5 份平行样品的黄芩苷平均萃取回收率均高于正交试验组，表明处理条件为最优条件；且5 份平行样品的萃取回收率较为接近，表明按最优处理方法处理大鼠血浆样品比较稳定。验证试验结果见表4。

表4 验证试验结果Tab 4 Results of validation test

3 讨论

通过测定正交试验黄芩苷的萃取回收率，在加入磷酸50 μl、甲醇2 ml，涡旋混合2 min，超声萃取10 min，以离心半径为4 cm、3 000 r/min 离心10 min，取上清液氮气流下吹干，取200 μl流动相复溶，涡旋混合1 min，以离心半径为3 cm、14 000 r/min离心5 min的条件下，应用HPLC法测定黄芩苷的峰形最好，血浆中的黄芩苷萃取回收效果最高。通过正交试验方差分析得出，加入磷酸量、甲醇量、超声萃取时间、离心时间对血浆中黄芩苷萃取回收影响显著。利用最优萃取工艺，可最大限度萃取血浆中黄芩苷。

为了减少试验过程中的误差，在样品处理时，采用内标法，以芦丁为内标物；通过参考文献，在血浆样品的处理时，通常采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂对血浆蛋白沉淀处理，芦丁和黄芩苷在甲醇中有较好的溶解率，且本研究中HPLC 色谱条件水相为甲醇-磷酸水溶液，所以采用甲醇对样品中血浆蛋白进行沉淀。通过最佳样品处理方法，样品中黄芩苷和芦丁的萃取回收率均能达到80%以上，且方法稳定可行，符合要求[10]。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：282.

[2]祝婧云，梁新丽，王光发，等.白芷提取物对黄芩活性成分黄芩苷的吸收促进作用[J].药学学报，2011，46（2）：232.

[3]邱枫，徐静华，肈丽梅，等.HPLC法测定大鼠血浆中黄芩苷的浓度[J].实用药物与临床，2009，12（5）：334.

[4]王丽，周慧芳，张艳军，等.高效液相色谱法测定小鼠血浆中黄芩苷含量及其药代动力学研究[J].长春中医药大学学报，2011，27（2）：160.

[5]项慧慧，杨洁红，傅旭春，等.正交试验法优选赶黄草的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：50.

[6]丁延虹，丁小全，贾忠，等.正交试验优选黄芩苷的新型提取方法[J].中国药房，2009，20（9）：658.

[7]贺葵邦，王英姿，张春泥，等.正交试验法优选地龙水提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（6）：33.

[8]赵珉，郭靖，张红岩，等.正交试验法优选舒欣胶囊中丹参酮ⅡA工艺[J].长春中医药大学学报，2011，27（3）：355.

[9]孔燕芳，周艳梅，闫艳仓，等.正交试验优选野菊花中总黄酮的提取工艺[J].中国药房，2013，24（43）：4 068.

[10]梁文权.生物药剂学与药物动力学[M].北京：人民卫生出版社，2007：320-325.