可溶性NKG2D配体降低NK细胞对骨髓瘤细胞杀伤功能的研究



短篇论著

可溶性NKG2D配体降低NK细胞对骨髓瘤细胞杀伤功能的研究

韩文敏1, 贾祝霞1, 姜玉1, 朱志超2, 张修文2,

肖溶1, 杨建和1, 卢绪章1

(江苏省常州市第二人民医院, 1. 血液科; 2. 中心实验室, 江苏 常州, 213003)

关键词:NKG2D配体; 自然杀伤细胞; 多发性骨髓瘤; 杀伤功能

人自然杀伤细胞(NK细胞)是人体抗肿瘤免疫的第一道防线，NK细胞通过识别自我的MHCⅠ类分子或Ⅰ类分子样的独特受体，可以识别和杀伤体内的肿瘤细胞[1-2]。体外实验[3-4]证实NK细胞对骨髓瘤细胞细胞具有很强的杀伤能力，但是肿瘤患者体内的肿瘤细胞可以逃逸免疫细胞的识别和杀伤，而且通过NK细胞输注治疗骨髓瘤患者并没有得到预期的效果，说明MM患者体内环境抑制NK细胞功能。作者以前的研究[5-6]表明NKG2D介导免疫细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用，作者通过检测MM患者血清中可溶性NKG2D配体水平变化，并通过细胞株模型探讨可溶性的NKG2D配体对NK细胞抗骨髓瘤能力的影响。

1材料与方法

1.1　一般资料

选取2009年3月—2013年12月在本院确诊的13例MM患者，中位年龄63岁(41～89岁)，所有患者均符合国内MM诊断标准，设为实验组。以30名健康志愿者为正常对照，中位年龄59岁(45～82岁)，对照组均无肿瘤及自身免疫性疾病史。收集的血清放在-20 ℃冻存，然后统一检测。

1.2　细胞及主要试剂

骨髓瘤细胞株U266由上海长征医院侯健教授惠赠，用含有10%灭活胎小牛血清(FBS)、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素的PRMI1640培养液，置于5% CO2，37 ℃培养箱内培养。流式细胞术抗体为美国Becton Dickinson公司产品流式细胞抗体包括CD3-Percp、CD56-FITC、NKG2D-PE及NK细胞分离试剂盒购买于R&D Systems公司。用于sMICA、sMICB检测的ELISA试剂盒购于北京来博生物科技公司。Transwell培养系统购于Nunc公司。流式细胞仪(BD FACS Canto Ⅱ)为BD公司。

1.3　研究方法

1.3.1流式细胞仪(FCM)测定：取待标记的细胞1×105/100 mL，分别加入4 μL荧光抗体，4 ℃避光反应30 min后用PBS洗2遍，用300 mL的PBS悬浮后上机检测，每标本记录细胞数为1×104个。利用FlowJO 软件进行数据分析。

1.3.2ELISA检测可溶性NKG2D配体水平：按照ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪于波长450 mm处测定吸光度(A)值，并计算出待测标本可溶性NKG2D配体(sMICA、sMICB)的表达水平。

1.3.3NK细胞分离和培养：将健康人单个核细胞用PBS洗涤2次，按NK细胞分离试剂盒说明书进行操作，分离纯化的NK细胞用含有10%FBS、100 U/mL IL-2、50 U/mL青霉素、50 UG/mL链霉素的RPMI1640培养基培养，并检测其表面NKG2D受体的表达水平。

1.3.4Transwell实验: Transwell上室加入2×105/200 mL的NK细胞悬液，对照组下室加入10%血清的1640培养液600 mL, 实验组下室加入2×105/600 mL的U266细胞。每组3个复孔，37℃培养箱培养48 h后检测NK细胞表面NKG2D受体的表达或用作效应细胞。

1.3.5NK细胞的细胞毒性试验：根据作者以前应用的方法[5]，骨髓瘤细胞U266预选用0.1 μM Calcein acetoxymethyl ester (CAM)孵育15 min后，标定的U266用PBS洗2次，然后用培养液重新调整细胞浓度，并按照5×105/孔放到圆底的96孔板中，然后按照的E︰T比值为10加入NK细胞，在培养箱里一起孵育8 h后用PBS洗1次，然后用结合缓冲液重新混悬细胞，然后用加入7-AAD抗体在常温中孵育15 min后用流式细胞仪检测特异性杀伤。特异性杀伤用百分比用公式：特异性杀伤(%)=(CT-TE/CT)×100% (CT表示在对照孔中活细胞的所占的比率，TE表示测试管中活细胞所占的比率)。

2结果

2.1　骨髓瘤患者血清可溶性NKG2D配体浓度

水平变化

比较健康人和初诊的多发性骨髓瘤患者外周血清中可溶性NKG2D配体的浓度，ELISA方法检测血清中NKG2D配体的浓度。多发性骨髓瘤患者外周血清中sMICA和sMICB的浓度分别是(156.4±47.1) ng/L和(106.2±35.3) ng/L，明显高于正常人的(57.2±26.7) ng/L和(44.6±23.5) ng/L(P<0.001)。

2.2　骨髓瘤细胞U266培养上清中可溶性

NKG2D配体的浓度

U266细胞培养24、48、72 h后用ELISA检查培养上清中NKG2D配体的浓度，随着培养时间的增多，骨髓瘤细胞培养上清中NKG2D配体的浓度逐渐增加。见表1。

表1　U266培养上清中sMICA和sMICB的表达水平　ng/L

2.3　可溶性NKG2D配体对NK细胞表面NKG2D受体及杀伤功能的影响

U266和NK细胞在Transwell共培养48 h检测NK细胞表面NKG2D受体，实验组NK细胞表面的NKG2D受体表达为(66.5±5.8)%，明显低于对照组的(96.8±7.4)%。作者用NK细胞为效应细胞，骨髓瘤细胞U266为靶细胞，检测NK细胞对U266特异性杀伤，实验组的NK细胞对U266特异性杀伤为(42.3±10.7)%，低于对照组的(62.8±15.6)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

人自然杀伤细胞是肿瘤生物治疗常用的一类免疫细胞，NK细胞的杀伤活性是通过其表面的活化型受体介导的NK细胞激活[7-8]，其中NKG2D是NK细胞表面重要的活化型受体，它可以识别肿瘤细胞表面相应的NKG2D配体从而杀伤肿瘤细胞，对NK细胞活性的调控起重要作用[9-11]。但是肿瘤细胞的金属蛋白酶可以水解细胞表面的NKG2D配体，从而形成可溶性NKG2D配体分子，诱导肿瘤细胞逃逸NK细胞识别和杀伤[12]。作者以前的研究表明患者的骨髓瘤细胞表面表达一定水平的NKG2D配体，免疫细胞通过NKG2D受体和配体的相互作用杀伤骨髓瘤细胞。作者进一步检测MM患者血清中可溶性NKG2D配体的浓度，发现MM患者血清中可溶性的NKG2D配体分子(sMICA，sMICB)明显高于健康人(P<0.001), 可溶性NKG2D配体可能是体内影响NK细胞功能的重要因素。

为了验证可溶性NKG2D配体对NK细胞功能的影响，作者以骨髓瘤细胞株U266为模型，验证骨髓瘤细胞分泌的可溶性NKG2D配体对NK细胞杀伤作用的影响。作者以前的研究[13]发现骨髓瘤细胞株U266表达一定水平的MICA/B蛋白分子，其培养上清可检测到一定水平的sMICA/B，而且随着培养时间的延长，其上清中sMICA/B浓度逐渐升高。作者用Tanswell共培养U266细胞和NK细胞48 h后可以发现NK细胞表面的NKG2D受体表达水平明显下降，同时U266共培养的 NK细胞对骨髓瘤细胞U266的杀伤作用明显降低，这说明骨髓瘤细胞分泌的可溶性的NKG2D配体分子通过降低NK细胞表面的NKG2D受体表达，从而降低了NKG2D介导的NK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用。

本研究表明，骨髓瘤细胞能够分泌可溶性sMICA/B配体分子，降低NK细胞表面NKG2D受体的表达，从而导致了NK细胞抗肿瘤能力的下降，这可能是MM患者体内NK细胞抗肿瘤能力下降的原因。改善肿瘤患者内环境，降低体内可溶性NKG2D配体分子水平，可能会改善体内免疫细胞抗肿瘤能力，从而提高患者的无病生存时间及总生存时间。

参考文献

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通信作者:卢绪章, E-mail: luxuzhang2008@163.com

基金项目:江苏省常州市卫生局重大科技项目(ZD201311)

收稿日期:2015-06-17

中图分类号:R 551.3

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)24-134-02

DOI:10.7619/jcmp.201524053