过表达microRNA-21对大鼠心肌梗死面积的影响

张小花　方五旺　管丽娟　王　斐　王腾飞

过表达microRNA-21对大鼠心肌梗死面积的影响

张小花1方五旺2管丽娟3王斐3王腾飞3

【摘要】目的：观察直接心肌注入microRNA-21基因腺病毒对大鼠心肌梗死面积的影响。方法：40只健康SD大鼠，随机分为五组：假手术组、模型组、生理盐水组、腺病毒载体组、microRNA-21腺病毒组，每组8只。假手术组只开胸、穿线，不结扎，也不注射任何物质。余4组通过结扎冠状动脉左前降支复制心肌梗死模型，其中模型组成模后不做其它处理，另3组成模后分别注入不同目标物质。饲养3天后一并处死，摘取心脏，采用实时荧光定量PCR检测左心室心肌microRNA-21表达量，采用TTC染色法测量心肌梗死面积。统计学分析各组上述指标间的差异。结果：microRNA-21腺病毒组microRNA-21表达量(0.72±0.01)较其它四组明显增加(P<0.01)，其它四组间差异无统计学意义(P>0.05)；假手术组未见心肌梗死，microRNA-21腺病毒组心肌梗死面积(31.27±1.60%)较其它三组明显减小(P<0.05)，其它三组心肌梗死面积差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：直接心肌注射microRNA-21基因腺病毒可实现心肌microRNA-21基因的过表达，进而减小心肌梗死面积。

【关键词】microRNA-21基因；过表达；心肌梗死；大鼠

Relationship between Myocardial Infarction Size and the Overexpression of Micro RNA-21

ZHANG Xiao-hua1,FANG Wu-wang2,GUAN Li-juan3,WANG fei3,WANG Teng-fei3

1Department of Cardiology,3Department of Geriatric, The Fifth People's Hospital of Chengdu City,Chendu 611130,China;2Department of Cardiology, The Second People's Hospital of Wuhu in Anhui Province,Wuhu 241000,China

【Abstract】Objective: To investigate the effects on myocardial infarction(MI) size through injecting gene adenovirus carrying micro RNA-21 (miR-21) into the myocardium directly. Method: Forty male mice were divided into sham group, model group, saline group, adenovirus vector group,miR-21 adenovirus group. The sham group was only opened and threaded without ligation and infusion. The remaining four groups were subjected to MI by left anterior descending artery (LAD) ligation, model group was left untreated,while the other three groups were infused different target materials into surrounding areas of MI after building model successfully. Then executed the mice and spayed the heart at 3th day concurrent. Expression of miR-21 in surrounding areas of left ventricular MI was detected with real-time PCR and MI size was measured with TTC dyeing. Results: The expression of micrornas-21 of injection with microras-21 adenovirus vector group (0.72±0.01) was significantly increased than the other four groups(P<0.01).There was no obvious differences among the other four groups; sham group had no myocardial infarction， while myocardial infarction size of micrornas-21 adenovirus vector group (31.27±1.60%) significantly decreased than the other three groups (P<0.05).There were no significant statistical differences among them. Conclusion: Intramyocardial injections by directly injection with miR-21 gene adenovirus vectors can realize overexpression of miR-21 gene, the gene expression of miR-21 in three days after myocardial infarction has the effect that reduce MI size.

【Key words】MicroRNA-21; Overexpression; Myocardial infarction; Mice

[作者单位]四川省成都市第五人民医院，成都 611130；1心内科；3老年病科；2安徽省芜湖市第二人民医院心内科，芜湖 241000

本文2015-07-20收到，2015-09-30修回

心肌梗死是指心肌缺血超过一定时间，心肌血液灌注量和需求量失去平衡，心肌细胞失去营养支持所致的心肌细胞坏死。传统的治疗方法主要包括药物溶栓、经皮冠状动脉支架介入(Percutaneous Coronary Intervention，PCI)以及冠状动脉旁路移植术(Coronary Artery Bypass Grafting，CABG)。但部分终末期患者并不适宜上述治疗，需寻求新的治疗方案。近年来，微小RNA(microRNA)已受到临床关注和应用研究。

MicroRNA是真核生物中的一种非编码单链小分子RNA，参与众多疾病的病理生理过程，如各种细胞之间的信号转导、细胞增殖和死亡、肌细胞收缩和舒张、神经元形成、心血管病变和病毒感染后的调节等[1]。载入或剔除相关microRNA基因可缓解或加重疾病进展[2]，或可作为循环标志物被用来检测心肌损伤[3]。而microRNA-21则是影响心肌梗死面积的重要调控基因，在多种类型心脏应激后表达增加[4]，是目前microRNA的研究热点。本文通过直接心肌注入携带microRNA-21基因的腺病毒至心肌梗死大鼠，观察过表达microRNA-21对原有心肌梗死面积的影响，为心肌梗死的基因治疗提供实验依据。

1材料与方法

1.1　实验试剂和器材

25%乌拉坦(皖南医学院药剂科)，TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑，上海汉恒生物研究所)，cDNA合成试剂盒(加拿大Fermentas公司)，Trizol(美国Invitrogen公司)，PCR扩增引物及SYBR Green PCR试剂盒(海捷瑞生物工程公司)，腺病毒载体Ad-miR21及空基因腺病毒载体(上海汉恒生物公司)，7-0缝线(上海浦东金环医疗用品有限公司)，4℃冰箱(青岛海尔公司)，微量注射器(大龙医疗设备上海有限公司)，HX-300动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，Powerlab/4ST型心电图机、AB104-N电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司生产)，体视显微镜(Olympus公司)等。

1.2　实验动物及分组处理

1.2.1动物及分组： 健康雄性SD大鼠40只，体重250±30g，购自安徽省合肥实验动物中心。随机分为5组：假手术组、模型组、生理盐水组、腺病毒载体组、microRNA-21腺病毒组，每组8只。

1.2.2心肌梗死模型的建立[5]：大鼠以25%乌拉坦(0.4ml/100g)腹腔注射麻醉后固定于鼠台，分离气管后行气管插管，连接动物呼吸机(呼吸频率50-60次/min，潮气量4-6ml/次)和心电图机(记录标准导联心电图)。开胸，常规暴露心脏及左室表面血管，以左冠状动脉主干为标志，于肺动脉圆锥与左心耳之间距主动脉根部约3-4mm处进针(深度2mm左右)，置放无创缝合线(7-0)，假手术组不行结扎，余4组进行缝扎。结扎后各组结扎区心肌活动幅度减弱或消失、心肌颜色较相邻区域变浅或变白(图1)，心电图各导联ST段抬高>0.2mv，持续30min为急性心肌梗死建模成功[5]，4组大鼠均成模。

1.2.3各组干预方法：假手术组及模型组大鼠均不予任何干预。生理盐水组、腺病毒载体组及microRNA-21腺病毒组用微量注射器分别吸取100μl生理盐水、腺病毒载体溶液、携带microRNA-21腺病毒溶液，按照图1标注的干预注射点直接注入梗死心肌周围。然后逐层缝合手术切口，关胸，拔除气管插管，腹腔注射青霉素防止术后感染。

1.3　检查指标和方法

术后，各组大鼠饲养3天，为方便比较，每组随机选取5只大鼠行以下指标检测(术后假手术组、模型组、生理盐水组、腺病毒载体组、microRNA-21腺病毒组大鼠分别存活8、6、5、6、7只)，采用前述麻醉和手术方法摘取心脏，用生理盐水冲洗表面血液后，于-80℃冰箱冻存。

1.3.1microRNA-21检测：取出冰冻心肌组织0.1g，采用实时荧光定量PCR检测心肌microRNA-21的表达量，反应体系为25μl，循环模式：94℃ 预变性2min，94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，40个循环，72℃ 10min,10℃ 20min，以U6作参照基因。采用相对定量法中的2-△△Ct方法分析各组microRNA基因相对表达量。

1.3.2TTC染色：按照以下步骤配制新鲜TTC溶液：将1L 0.1M Na2HPO4溶液与0.5L 0.1M NaH2PO4溶液混合，调整pH值为7.4,取混合液100ml，将1g TTC粉剂溶于其中即得1%新鲜TTC溶液。取出冰冻心脏，做垂直左心室长轴连续切片，厚1-1.5mm。将心肌组织切片置于1%TTC液中，于37℃水浴15min，然后置于10%福尔马林固定10min后于体视显微镜下观察，拍照。用Image Pro Plus 6.0软件分析照片，量化心肌梗死面积，以纤维组织区域(苍白区的心肌)占整个切片(苍白区加上染色的心肌)的百分比表示。

1.4　统计学处理

2结果

2.1　各组microRNA-21表达量比较

各组microRNA-21表达差异有统计学意义(F=2.649，P<0.05)。模型组、生理盐水组、腺病毒载体组与假手术组间差异均无统计学意义(P>0.05),而microRNA-21腺病毒组microRNA-21表达水平显著高于其它四组(t值分别为3.714、3.513、3.368、3.472，P<0.01)。见表1。

表1　各组microRNA-21基因相对表达量和心肌梗死

注：与假手术组比较，1)P<0.01；与模型组、生理盐水组、腺病毒载体组比较，2)P<0.05,3)P<0.01

2.2　各组心肌梗死面积比较

假手术组心肌组织为砖红色，未见心肌梗死，余四组均可见到有明显心肌梗死(苍白区)，microRNA-21腺病毒组梗死面积较小，见图2。定量分析显示，四组心肌梗死面积差异有统计学意义(F=5.063，P<0.01)。microRNA-21腺病毒组心肌梗死面积小于模型组、生理盐水组和腺病毒载体组(t值分别为2.371、2.614、2.601，P<0.05)。模型组、生理盐水组和腺病毒载体组三组间心肌梗死面积差异无统计学意义(F=2.239,P>0.05)。见表1。

[本文图1、图2见封3]

3讨论

本实验采用经典心肌梗死模型，制作时将结扎部位选择在主动脉圆锥和左心耳交界处往下3-4mm，提高了大鼠成模率和存活率，同时选取腺病毒载体携带microRNA-21直接心肌注射，不仅具有良好的安全性，较高的转染效率，相对长的表达时间，而且操作便捷，充分保障了实验的科学性和时效性。结果表明microRNA-21腺病毒组注入3天后，其心肌组织microRNA-21表达水平显著升高，心肌梗死面积明显小于模型组、生理盐水组和腺病毒载体组。提示心肌过表达microRNA-21可对心肌梗死起保护作用。

治疗心肌梗死目前常选择溶栓和冠脉介入来开通血流以拯救坏死心肌和提高心脏功能[6，7]。探讨基因治疗也是基础和临床研究的热点。microRNA-21与心血管疾病密切相关，已被很多研究，包括本实验证实其在心肌梗死早期的病理过程中起到调节作用，因此可能是治疗心肌梗死的新靶点[8]。

但microRNA-21减少心肌梗死的作用机制尚不明确。有研究[9]证实，过表达microRNA-21可以减少梗死心肌周围的胶原沉积，并可通过调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)减少心肌细胞凋亡，提高心脏功能。更重要的是，过表达microRNA-21还可通过调节转化生长因子-β(TGF-β)受体II来极大地激活纤维母细胞增殖和分化，通过一系列机制促进心脏结构和功能的重塑，促进梗死后心肌组织的修复，有效防止心脏破裂[10-12]。此外，有研究报道,microRNA-21在血管平滑肌和心肌细胞增殖和凋亡中亦扮演了重要的角色[13]。

综上所述，提高心肌microRNA-21表达水平可减少心肌梗死面积，因而有可能成为心肌梗死基因治疗的新靶点，但其具体机制尚需进一步研究。

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张小花(1986-)，女，汉族，硕士，住院医师，研究方向：冠心病的预防和治疗

参考文献

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4Dong S,Ma W,Hao B,et al.microRNA-21 promotes cardiac fibrosis and development of heart failure with preserved left ventricular ejection fraction by up-regulating Bcl-2[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014，7(2): 565-574.

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8Zile MR, Mehurg SM, Arroyo JE,el al. Relationship between the temporal profile of plasma microRNA and left ventricular remodeling in patients after myocardial infarction[J]. Circ Cardiovasc Genet,2011,4(6):614-619.

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13Yang Q, Yang K,Li A,et al.Anti-apoptosis and expression of microRNA-21 in rat myocardium during early ischemia-reperfusion injury[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2013， 38(5): 483-489.

作者简介：本文第一

[中图分类号]R541.4

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2015)04-0028-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．007

微循环学杂志，2015，25（4）：28－31

© 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION