口服6种补益类中药提取物对提高口蹄疫疫苗免疫抗体应答水平的研究

马艳粉，张丽丽，苏小艳，赵兴绪，胡松华*

(1.甘肃农业大学 动物医学学院，甘肃 兰州 730070；2.浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058)

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的发生在偶蹄兽的一种高度接触性传染病。FMD 传播迅速、流行范围广，主要危害牛、羊、猪等家畜，被OIE 列为必须通报的传染病之一。采用FMD 灭活疫苗是许多国家控制该病暴发的主要手段[1-2]。目前，我国采取用FMD 灭活疫苗有效控制了FMD 的流行。但有些报道称常规疫苗存在抗原用量不足，不能够提供足够免疫保护力的问题[3]。因此，研究如何提高FMD 疫苗免疫的效果具有主要的实际意义。

补益类中药，如人参、当归、黄芪、枸杞、党参、白术、甘草等，可以增强机体抵抗力，其有效成分主要有多糖、甙类、生物碱、挥发油、黄酮等。最新研究表明，黄芪多糖(APS)可有效地增强雏鸡黏膜的屏障作用，提高机体的免疫能力[4]。人参皂甙具有免疫佐剂作用，人参根总皂甙和Rb1 对细小病毒病疫苗和金黄色葡萄球菌疫苗具有免疫佐剂作用[5-8]。人参皂甙Rg1 对卵清白蛋白和猪细小病毒病疫苗也具有佐剂作用[6-9]。动物实验结果表明，APS 与重组人乙肝疫苗合用能明显提高小鼠的抗乙肝病毒的阳转率，减少抗原用量，效果优于氢氧化铝佐剂[10]。本研究将GS-R、GSLS、RAMPS、CPS、GPS 和APS 6 种中药提取物经口服途径给药，对FMD 灭活疫苗免疫应答具有增强作用，为临床上应用中药提高疫苗免疫效果提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 猪FMD O 型灭活疫苗(OS/99+OZK/93 株)购自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂(生产批号：1007001)；抗猪O 型FMD 兔血清、猪O 型FMDV 抗原均购自中国农业科学院兰州兽医研究所；HRP 标记山羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)购自上海优宁维公司；HRP 标记山羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 购自Beckman Coulter 公司；人参皂甙(80 %)和GSLS(80 %)购自吉林宏久药业有限公司；生药白术、党参、甘草和黄芪购自浙江省中医药大学实验药厂。

1.2 实验动物 清洁级雌性ICR 小鼠(体质量为20 g～22 g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号码SCXK(沪)2012-0002。饲养于实验室自购IVC 独立送风饲养笼具。饲喂灭菌饲料和饮水，室内温度为24 ℃±1 ℃，湿度为50 %±10 %。动物饲养适应1 周后开始实验。

1.3 中药提取物的制备 多糖的提取、分离和纯化按参考文献[10]操作。用苯酚-硫酸法对所得多糖进行含量测定，提取物中RAMPS、CPS、APS 和GPS 含量分别为89.63%、90.08%、82.5%、84.8%。

1.4 动物分组和处理 将114 只雌性ICR 小鼠随机分为19 组，每组6 只；6 种提取物每种设高、中、低剂量3 组，对照组给生理盐水(表1)。将提取物溶解在生理盐水中，每只小鼠每天灌胃0.25 mL，连续4 d。于第5 d 腹股沟部皮下注射O 型FMD 疫苗免疫，0.2 mL/只，2 周后采取同样方法加强免疫一次。于二免后1～5 周每周眼球采血1 次，分离血清置-20 ℃保存。

1.5 血清抗体水平检测

1.5.1 各组血清IgG 水平比较 在96 孔酶标板中每孔加入50 μL 兔抗O 型FMDV 血清包被液(以0.05 mol/L pH9.6 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液1∶1 000稀释)，4 ℃过夜。用含0.05%(v/v)Tween-20 的PBS(PBST)洗涤5 次，每次3 min(下同)。以5 %脱脂乳的PBS 封闭液，室温孵育2 h 后洗板，每孔加入50 μL 1∶10 稀释的O 型FMDV 抗原，4 ℃孵育2 h。洗板，加入经1∶40 稀释待检血清和阴性血清，每孔50 μL，37 ℃孵育1 h。洗板，以山羊抗鼠IgG-HRP(1∶800)为检测抗体，50 μL/孔，37 ℃孵育1 h。洗板，加入TMB 底物溶液显色，50 μL/孔，37 ℃孵育15 min。每孔加50 μL 2M H2SO4终止反应。测定OD450nm值，比较各组抗体水平。

表1 实验设计Table 1 Experimental design

1.5.2 血清IgG 效价检测 根据1.5.1 中血清特异性IgG 的检测结果，筛选出每种中药成分中可增强FMD 疫苗免疫效果最佳组，进行血清特异性IgG 效价的检测。检测方法基本同IgG 抗体。在加入50 μL 1∶10 稀释的O 型FMDV 抗原孵育并洗板后，加入待检血清和阴性血清，每孔50 μL，血清初始稀释度为1∶20，进行2 倍倍比稀释至1∶40 960，37 ℃孵育1 h。

1.5.3 血清IgG 亚类检测 将1.5.2 中筛选出的血清样品进行抗体亚类的检测，方法基本同总IgG 抗体。在加入1∶40 稀释的待检血清孵育并洗板后，分别加入1∶1 000 稀释HRP 标记羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b 或IgG3 抗体，50 μL/孔，37 ℃孵育15 min。后续步骤同总抗体IgG 的检测。

1.6 数据统计 实验数据采用SPSS(11.5)统计软件中One-Way ANOVA post-hoc 多重比较的Duncan 法进行检验。

2 结果

2.1 口服补益类中药提取物组小鼠血清IgG水平各组小鼠分别口服不同剂量的6 种中药提取物后，免疫FMD 疫苗，并在二免后一周开始检测免疫鼠的抗体水平。结果显示，口服6 种提取物均可提高抗体水平，提高抗体水平幅度依次为APS>GSLS>GPS>GS-R>RAMPS>CPS 组。其中APS 25 mg/只/d组、GSLS 0.5 mg/只/d 组和GPS 25 mg/只/d 组 与对照组相比，可显著提高小鼠抗FMDV 抗体水平，而RAMPS 50 mg/只/d 组、CPS 100 mg/只/d 和GS-R 0.05 mg/只/d 组与对照组相比无显著性差异(p<0.05)(图1，图2)。

图1 口服不同剂量的中药提取物对血清特异性IgG 的影响Fig.1 Effects of oral administration of herbal extracts with different doses on serum specific IgG response

图2 中药最佳剂量时对血清特异性IgG 的影响Fig.2 Effects of herbal extracts with optimal doses on mouse serum specific IgG response

2.2 补益类中药提取物口服对血清IgG效价的影响从每种提取物的3 个剂量组中，选出IgG 水平最高的剂量组，检测其IgG 效价，结果显示：对照组小鼠免疫前未口服中药，二免后的血清抗体效价为1∶80；其它小鼠免疫前口服中药提取物APS、GSLS、GPS、RAMPS、GS-R 或CPS，二免后的血清抗体效价分别为1∶640、1∶640、1∶320、1∶269、1∶226、1∶135，分别是对照组抗体效价的8 倍、4 倍、3.4 倍、2.8倍、1.7 倍，其中口服APS、GSLS、GPS 的小鼠血清抗体效价显著高于对照组(图3)。

2.3 补益类中药提取物口服对血清IgG亚类的影响口服6 种中药提取物对FMDV 疫苗诱导的IgG 亚类有不同程度的增强作用，其中对IgG1 具有显著增强作用的有APS、GPS 和GSLS(p<0.05)；对IgG2a 具有显著增强作用的有APS、GPS、RAMPS 和GSLS(p<0.05)；对IgG2b 具有显著增强作用的有APS、GPS、RAMPS、GSLS 和GS-R(p<0.05)(图4)。

图3 口服中药提取物对血清特异性IgG 效价的影响Fig.3 Effects of herbal extracts on mouse serum specific IgG titers

3 讨论

图4 口服中药提取物对血清特异性IgG 亚类的影响Fig.4 Effects of herbal extracts on mouse serum specific IgG subclasses

本研究表明在免疫FMD 疫苗之前，给小鼠口服补益类中药的提取物APS、GPS、RAMPS、CPS、GS-R 和GSLS 可以不同程度提高特异性抗体IgG 水平，其中以APS、GSLS 和GPS 对抗体的提高幅度最大，IgG 效价分别是对照组的4～8 倍，具有统计学显著性，对小鼠的IgG 亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3 也有显著提高作用。表明口服APS、GSLS和GPS 这3 种中药提取物可显著提高小鼠抗MFDV的抗体水平,对Th1 和Th2 型免疫反应均有促进作用。在抗原用量一定的情况下，使FMD 疫苗的免疫效果得到显著提高，在生产实践中具有重要意义。

Li 等和Xie 等报道白术水煎和RAMPS 口服可以增强FMD 疫苗的免疫效果[11-12]，本研究对RAMPS 的研究结果和前期报道的一致。Zhai 等报道给鸡饮水口服GSLS 水溶液然后免疫鸡新城疫疫苗或鸡禽流感疫苗，可以显著提高特异性抗体水平[13]。本研究证明GSLS 对FMD 疫苗免疫同样具有增强作用。补益类中药药性和缓，“扶正固本”为其主要功能。目前对许多疾病的防治，如肿瘤病、病毒病、免疫缺陷病，以及解决大量抗生素应用所导致的药物残留、耐药菌株出现等问题，西医显得力不从心，而补益类中药往往以其益阴扶阳，培补脾肾，即可增强机体抗病力，促进正常功能的恢复，显示了其独特优良的疗效[14]。本研究中也表明补气类中药提取物对疫苗免疫有不同程度的增强作用。

综上所述，小鼠口服6 种中药提取物对FMD疫苗免疫均具有增强作用，提高抗原特异性IgG 及其亚类的水平。其中口服GSLS、APS 和GPS 的免疫增强幅度最大，有必要更加深入广泛的研究，促进中药免疫增强制剂的研发。

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