彗星试验技术在水生与土壤环境中的毒理学应用

卞方杰，邢美燕，杨健，孙文，潘赛

污染控制与资源化研究国家重点实验室，长江水环境教育部重点实验室，同济大学，上海 200092



彗星试验技术在水生与土壤环境中的毒理学应用

卞方杰，邢美燕*，杨健，孙文，潘赛

污染控制与资源化研究国家重点实验室，长江水环境教育部重点实验室，同济大学，上海 200092

彗星试验是一种检测真核细胞脱氧核糖核酸(DNA)损伤的技术，快速、低成本、适用于几乎所有真核细胞，因此常应用于遗传毒理学、辐射生物学、肿瘤细胞学、毒性检测等方面。尤其以灵敏度高、检测联合毒性的特点大量运用于环境研究中。主要介绍彗星试验方法学发展历程，彗星试验的原理及其在环境领域中的应用，并指出应用中的受限因素以及未来的发展前景，为今后进一步推广该试验技术提供理论上的指导与参考。

彗星试验；遗传毒性；DNA损伤；污染评价；生物检测

近年来，随着经济的迅猛发展，我国的生态环境也承受着前所未有的风险。大量的污染事件频繁暴发，昭示着环境的脆弱。同时各类新兴污染物不断曝光，逐渐引起学者与公众的关注，如环境内分泌干扰物(EDCs)，持久性有机污染物(POPs)，有机磷阻燃剂(OPFRs)，溴代阻燃剂(BFRs)等。而在对这些污染物的深入研究中，人们越来越多地把目光聚集到毒理方面，并致力于定性定量评估这些物质对生态环境，对生物体造成的毒性效应。

在环境科学领域，细胞和分子水平的诊断技术，如DNA损伤检测技术，由于其特异性和实用性等优点，在污染评价与生物检测方面异军突起。外界环境中的理化因素对细胞脱氧核糖核酸(DNA)的损伤是引起基因突变和癌变的主要原因，因此判断细胞DNA是否损伤是环境监测中重要的一环。彗星试验(comet assay)又称单细胞凝胶电泳试验(single cell gel electrophoresis，SCGE或SCG)，是一种检测真核细胞DNA损伤的常用方法。该方法可以对遗传毒性物质产生的多种DNA损伤(单链断裂、双链断裂等)进行定性和半定量的检测。同时该技术具有检测敏感性高，样品所需细胞数量少，灵活低成本，试验周期短等特点。近些年来，该方法广泛应用于遗传毒理、环境监测和细胞凋亡等研究，其中在健康风险评估中的应用已成为目前研究的焦点。关于彗星试验的文章多立足于技术上的应用，鲜有关于彗星试验方法学发展历程的概述，也未有从大环境的宏观角度进行综述，所以本文从彗星试验方法学发展展开，介绍试验原理及其在水生环境、土壤环境中的应用，也指出该方法一定的局限性与发展空间，旨在为进一步推广该技术提供参考与指导。

1 彗星试验方法学发展历程(Methodologicaldevelopment of comet assay)

1.1 国际研究者对彗星试验方法学的探究

1984年Ostling和Johanson[1]首次提出电泳pH9.5情况下的彗星试验版本，当时认为彗尾是DNA超螺旋的释放，现在的研究表明其实是一些紧密的DNA环在电泳下形成的光圈。

1988年，Singh等[2]对试验过程进行改良，主要是将电泳过程中的pH提高至13，在此版本下可以检测到DNA单链损伤(SSB)、ALS(碱性易变位点)、DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联和与SSB相关的修复。该版本得到很多国际组织的认可，成为经典版本。

1995年，ICAW(The International Comet Assay Workshop)在第二届ICEM研讨会(International Conference on Environmental Mutagens)上成立，每两年一届，至今已举办10次(10thICAW，Porto，Portugal，16-17Sep 2013)，是彗星试验领域最全面，最专业的研讨会，每届会议上都会讨论关于彗星试验理论、实践方面的研究进展和这项技术的最新应用。

1999年，IWGT(国际基因毒性检测课题组)专家达成共识，认为1988年Singh的碱性检测版本是最佳版本，并概括了其成本低，试验周期短，灵活敏感的特点，同时讨论了试验中操作步骤对应的机理，如何在载玻片上铺胶，以及细胞毒性在结果中难以显示清楚等问题[3]。

2005年，第四届IWGT研讨会召开，期间召集专家组成彗星试验专家组，讨论了多剂量与单一剂量，不同的细胞提取方式，细胞毒性，不同的图像分析系统对试验结果的影响[4]。

2010年，欧洲彗星试验组织ECVAG成立，该组织的研究重点是研究彗星试验中DNA损伤和修复的差异性。通过研究表明，在用彗星试验检测DNA损伤和FPG(甲酰嘧啶)敏感位点时，不同试验室的差异很大，但是浓度和损伤的关系在每个试验室中都可以检测到。此外，不同数据分析系统带来的影响远大于试验操作规范不同的影响，同时ECVAG也在向制定国际统一的彗星试验操作规范而努力[5]。

2011年，第八届研讨会上由Andrew Collin等领军人物提出建立运用彗星试验对人体进行生物监测的计划，并在第九届会议上得以确定为“ComNet”计划，并成立专门的网站(www.comnetproject.org)来收集数据[6]。这些系列研讨会为彗星试验的深入探究及推广做出了相当大的贡献。

1.2 国内研究者对彗星试验方法学的发展

国内早期对彗星试验的研究主要包括引用介绍、研究应用、方法改进三个方面。20世纪末国内开始出现了大量关于单细胞凝胶电泳技术的介绍[7-8]，随后该方法被陆续用于癌细胞研究、人血淋巴细胞研究、细胞凋亡研究、毒性检测等领域。

四川大学张遵真教授及其课题组在彗星试验技术的探索与推广方面做了大量工作，是国内本领域的领军力量。曾就彗星试验裂解时间、解旋时间、电压电流等进行筛选，寻求最优化实验条件[9]。也对传统染毒、悬浮染毒两种染毒方式进行了对比，提出了悬浮染毒更敏感，节约细胞与时间，均匀性好的结论，建议作为哺乳动物细胞的首选染毒方式[10]。此外，他们还建立了一种非荧光染色的实验方法：银染法。该方法具有染色清晰，敏感性高，可直接用光学显微镜观察的特点，促进了彗星试验的进一步推广[11]。

在实验操作步骤方面，牛勇等[12]研究了乙醇脱水干燥法保存胶片的稳定性及系统性。罗明志等[13]对制胶，水洗，电源选择和脱水等主要实验步骤进行了改进。刘丰等[14]对制胶方法稍加改良，使之可处理大批量的样品。欧红梅等[15]对彗星试验的国际联合验证进行了详细介绍，从给药方案设计、取样等6个方面阐述了较公认的体内彗星试验方法，具有较重要的借鉴意义。

国内研究者针对不同实验对象也确立了不同的实验方案。徐海娟等[16]采用大鼠微量全血法代替传统的分离-富集法，使实验方法更简单，便于大规模的检测工作。鲁志松等[17]针对人体颊黏膜细胞彗星实验探讨了最适条件。陈建伟等[18]建立了双尾彗星试验法来检测精子的DNA完整性。这些不同方法学的建立表明了彗星试验技术已得到国内研究者们的继承与发展。

闫学昆等[19]对彗星试验图像采用的传统迭代阈值分割法进行改进，并推广至双阈值分析法。该方法快速，可靠，分割效果理想，并可实现图像的自动分割。这是国内少有的对彗星试验图像分析系统的改良，为提高不同实验室之间结果的可比性做出了较大贡献。

国内多年来对彗星试验的发展主要集中在实验步骤与条件优化方面，涉及机理较少，但我们看到该技术已慢慢得到研究者的认同与青睐，且在各领域得到大量应用，前景可观。

2 彗星试验在环境领域的应用(Applications ofcomet assay in the environmental field)

2.1 彗星试验的原理

彗星试验是通过将细胞悬浮液固定在载玻片上的琼脂糖里，浸泡在高盐分、高碱度的裂解液里裂解细胞膜，排出细胞质，使DNA紧密的超螺旋结构裸露，继而在之后的过程中解旋开来，损伤的DNA片段暴露出负电荷，并在电泳时向阳极迁移，形成“彗尾”，而完整的DNA没有迁移，形成“彗核”，再通过染色和显微拍照记录。通过尾长、尾矩、Oliver尾矩等指标来显征DNA的损伤程度，且可以较好地表达污染物遗传毒性的剂量-效应关系。

2.2 彗星试验在环境领域的应用

彗星试验最早应用于检测电离辐射对DNA的损伤研究中，如今在基因毒性测试[20]、人体研究[21]、DNA修复测试[22]等领域均有很广泛的研究。而随着环境领域方面的研究越来越多，越来越深入，彗星试验已经成为一项常用技术普遍用于污染物质的毒性检测中。

2.2.1 水环境中的应用

水环境是构成环境的基本要素之一，是人类社会赖以生存和发展的重要场所，也是受人类干扰和破坏最严重的领域。水环境中污染物质种类复杂，衍生物繁多。通过原位取样和实验室模拟两种方法，脊椎水生生物、无脊椎水生生物、水生植物彗星实验都得到很广泛的研究(表1)。

随着研究的不断深入，人们越来越多地关注利用水环境中的特定生物研究及评价新型污染物的基因毒性。例如利用贻贝研究烟草提取物[23]和内氯氰菊酯的浓度[24]。

其中，人类活动对水环境利用的起源便是河流水源与饮用水环节。Kolarevic[31]研究了复杂环境下彗星实验参数与各种有机物以及环境之间的联系。通过检测贻贝血细胞彗星试验参数，发现尾矩与水环境中锌、温度、溶解氧呈现很好的相关性。Alink[32]监测了1978-2005年近30年莱茵河河水对荫鱼的彗星实验数据，为环保决策提供了有力的支撑。Rajaguru等[33]利用鲤鱼、蚯蚓分别作为印度Noyyal河河水和底泥的毒性指示生物，研究了河流沿程毒性的变化情况，为海洋环境的综合评价指标及风险评价体系提供了新方法及重要的手段。

檀丽[34]应用蚕豆根尖微核试验、彗星试验技术对8种代表性DBPs(消毒副产物)进行遗传毒性评价，发现彗星试验8种毒性损伤都可以检测出，而微核试验只检测出5种，并且发现蚕豆根尖彗星试验对5种卤乙酸(HAAs，重要的消毒副产物)的检出限比其他检测系统要低。因此，在进行进一步的监测数据积累后，有望将该试验用于饮水遗传毒性原位监测。

在水环境毒性监测中更具意义的应用是用于废水的检测，尤其是工业废水。随着现代工业的迅速发展，实际水体和排放水体中的致癌物、难降解物质、重金属等有毒物质的种类和含量大大增加，对环境影响很大。逐一检测各个污染物的毒性和含量相当繁琐且没有必要。综合毒性的测量手段应运而生，又以敏感度高，灵活快速的彗星试验应用广泛。

凌发忠等[35]对彗星试验稍加改进后，利用嗜热四膜虫对医药工业废水进行检测，结果发现彗星试验可以快速准确的检测出各类医药废水的毒性，相对其他化学分析法等有着不可替代的优势。张遵真等[36]利用改良的彗星试验对污水处理厂进出水、造纸厂、制革厂废水进行检测，总结了利用彗星试验检测工业废水对DNA损伤的诱导性的特点：无需预处理，直接检测；反映废水里多种物质的联合毒性作用，更具实际意义；可通过不同稀释倍数的废水毒性的检测来大致确认废水排出厂后的影响范围。

表1 水环境中某些生物彗星试验

2.2.2 土壤环境中的应用

环境保护部和国土资源部2014年发布了全国土壤污染状况调查公报，调查结果显示，全国土壤环境状况总体不容乐观，部分地区土壤污染较重，工矿业废弃地土壤环境问题突出。重金属、DDT等农药、POPs、PAHs各种污染物引发的社会事件不断出现。大量除草剂和杀虫剂的使用，可能会影响非目标生物的生长，导致土壤的结构和功能生态系统的不可逆破坏[37]。土壤是一个复杂的释义动态系统，对各类污染物调节作用不尽相同。因此取得当地土壤指示标志物显得十分重要，而其中蚯蚓被认为是非常合适的陆地生物生态毒性测试的模型[38]。

蚯蚓根据不同的目的不仅被用作杀虫剂、重金属的指示标志物(表2)，而且在新型材料毒性检测方面也有很广泛的应用。Hu等[44]实验室研究了多壁碳纳米管及吸附材料五氯酚钠对赤子爱胜蚓的毒性实验，试图说明两种“捆绑”的化学物质的联合毒性。Sforzini等[45]用人造土壤为基质背景，比较了微核试验和彗星试验在苯并[a]芘与四氯二苯并-p-二恶英不同浓度下的蚯蚓遗传毒性。不同的原理以及数据信息来源，使得彗星试验能够与其他分子诊断技术联合使用，更好的为环境决策做支撑。

植物彗星试验是彗星试验的另一重要分支，凭借更高的敏感性，样本的选择性更强，应用规模更广的特点同样得到了研究者的青睐，大量应用于土壤环境的毒性检测。1996年Koppen[46]首次提出了植物彗星试验的理念，随后，国内外研究学者开始使用植物彗星试验技术开创出一片新的毒性检测领域。林爱军等[47]采用了机械分离细胞核的方法分析了6种不同植物组织细胞进行彗星试验的情况。曹玉伟等[48]对植物彗星试验的细胞核分离方法，试验操作进行了详细介绍，同时较全面地综述了其在生态毒理领域的应用及植物修复机制。

表2 土壤环境中彗星试验应用研究

3 研究展望

彗星试验是一种较为年轻的方法，潜力还没有被完全发掘出来，在不久的将来也许能够作为标准方法应用于环境生物毒性检测。彗星试验与染色体畸变试验和微核试验等技术联合应用研究逐步受到研究者的关注[49]。此外研究者还尝试利用FPG彗星试验对胆固醇逆向转运DNA损伤指示空气颗粒物质危害[50-51]。

近些年科学家们对不同试验室结果出现的差异化现象，活体内(in vivo)、活体外(in vitro)不同染毒方式的区别等方面投入了大量精力进行研究。Godschalk等[52]人通过对欧洲5个国家，12个不同试验室对PBMC(外周血单核细胞)中的FPG(甲酰嘧啶)敏感位点和SB(DNA链损伤)进行比较，结果表明前者差异不大，而后者具有显著性差异。此外还发现采用统一的细胞提取手段并不能降低各试验室结果之间的差异性。这对2013年ECVAG的相关研究是进一步的印证[53]。而早在2009年Zainol等[54]也尝试使用自制的标准化方法来降低试验室之间试验结果的差异性。

彗星试验方法学的研究从自Ostling和Johanson首次提出彗星试验后始终继续着，常用的彗星试验检测的是一种综合毒性，随着应用越来越广泛，试验对象越来越复杂，不同的细胞，它的提取方式，试验条件的控制都不同，虽然都能得到阴性或阳性的结果，浓度与结果的对应关系，但不同实验室之间几乎不能相互定量比较，这些都是试验本身性质带来的局限性。DNA损伤的原因和种类有很多，污染物及其大量衍生物本身会对DNA产生复合损伤，同时损伤的细胞会引发炎症等症状产生二次损伤[55]，因此很难从结果去区别损伤类型或是研究作用机理。此外，图像数据处理(IA)系统是影响试验结果差异的重要因素，研发更准确，更有效的IA系统也是当务之急。

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The Toxicologic Applications of the Comet Assay in the Aquatic and Soil Environment

Bian Fangjie, Xing Meiyan*, Yang Jian, Sun Wen, Pan Sai

Key Laboratory of Yangtze River Water Environment Ministry of Education, State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, Tongji University, Shanghai 200092, China

Received 6 October 2014 accepted 12 November 2014

The comet assay is a rapid and cost-effective protocol of measuring deoxyribonucleic acid (DNA) damages, highly suitable for almost all eukaryotic cells. Therefore, it is widely used in the field of genetic toxicity, radiation biology, tumor cytology, toxicity detection etc., particularly with wide applications in environment researches due to its high sensitivity and detection of joint toxicity. This paper mainly reviews the development of the comet assay methodology, its experimental principles and applications in the aquatic and soil environment. More importantly, the limited factors and future prospects for the applications of comet assay in this paper are documented to provide a theoretical guidance and reference for popularizing the comet assay.

comet assay; genetic toxicity; DNA damage; pollution assessment; biological monitoring

中央高校基本科研业务费专项资金(0400219187)

卞方杰(1991-), 男, 硕士, 研究方向为环境毒理学, E-mail: bfj222000@126.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: xmy5000@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20141006001

2014-10-06 录用日期：2014-11-12

1673-5897(2015)3-063-08

X171.5

A

邢美燕(1977-)，女，同济大学环境学院市政工程博士，副教授，主要研究方向为污水与废水处理理论与资源化技术。

卞方杰, 邢美燕, 杨健, 等. 彗星试验技术在水生与土壤环境中的毒理学应用[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(3): 63-70

Bian F J, Xing M Y, Yang J, et al. The toxicologic applications of the comet assay in the aquatic and soil environment [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 63-70 (in Chinese)