丹参注射液对大鼠急性胰腺炎的预防机制研究

丁凤珍, 汤可琴

(江苏省常州市中医医院, 1. 药剂科; 2. 消化内科, 江苏 常州, 213003)



论著

丹参注射液对大鼠急性胰腺炎的预防机制研究

丁凤珍1, 汤可琴2

(江苏省常州市中医医院, 1. 药剂科; 2. 消化内科, 江苏 常州, 213003)

摘要:目的探讨丹参注射液对大鼠急性胰腺炎(AP)的预防作用及其对核因子κB(NF-κB)、淀粉酶(Amy)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平的影响。方法SD大鼠36只， 随机分为假手术组、模型组、丹参治疗组，各12只。建立AP大鼠模型。丹参治疗组造模前30 min尾静脉注射丹参注射液；模型组造模前30 min尾静脉注射生理盐水。造模成功6 h后腹主动脉采血2 mL，并取胰腺组织标本，检测Amy、IL-6、TNF-α等指标水平。结果大鼠血清Amy、IL-6及TNF-α水平，胰腺组织中MDA、NF-κB水平，及组织病理学评分比较，丹参治疗组高于假手术组，低于模型组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。大鼠胰腺组织中SOD水平比较，丹参治疗组低于假手术组，高于模型组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01) 。结论丹参注射液对大鼠AP具有一定的预防作用，可减轻AP的病理损害程度，降低Amy、IL-6、TNF-α及NF-κB水平，清除氧自由基，减轻脂质过氧化反应程度。

关键词:丹参注射液; 大鼠; 急性胰腺炎; 淀粉酶; 核因子-κB; 肿瘤坏死因子-α

急性胰腺炎(AP)是临床常见的急腹症，起病急，病情凶险，进展快速，重症患者死亡率高达10%～30%[1]。AP的病因及发病机制复杂，有众多因素参与。在发病早期，各种因素引起胰腺腺泡内多种酶原被激活、各种炎症细胞因子释放，机体免疫应答失控等连锁反应，易产生全身炎症反应综合征(SIRS), 严重时可致多器官功能障碍综合征(MODS)等[2]。丹参对AP组织损害具有明确的保护作用，因此在临床上常用于辅助治疗AP[3]。本研究在AP大鼠造模前给予丹参注射液，探讨其对大鼠胰腺病理损害的预防作用，现报告如下。

1材料与方法

1.1　材料

牛磺胆酸钠，购自上海铭睿生物科技有限公司，批号MR80419; 丹参注射液，购自江苏正大天晴药业股份有限公司，国药准字Z32021228，规格2 mL/支；淀粉酶(Amy)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、IL-6、TNF-α试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司；NF-酶B鼠单克隆抗体，购自Santa Cruz公司。

1.2　实验动物及分组

健康成年清洁级SD大鼠36只，雌雄不拘，体质量290～330 g, 购自南京君科生物工程有限公司。随机分为3组，设为假手术组、模型组、丹参治疗组，各12只。

1.3　动物模型建立

假手术组大鼠尾静脉注射生理盐水1.5 mL/kg, 30 min后麻醉开腹，进腹后仅显露并轻翻动胰腺即关腹。丹参注射液组大鼠造模前30 min尾静脉注射丹参注射液1.6 mL/kg; 模型组尾静脉注射生理盐水1.5 mL/kg。AP大鼠模型的建立参照文献方法[4]，具体如下：丹参注射液组及模型组大鼠术前禁食12 h以上，自由饮水。采用质量分数为2.5%的戊巴比妥钠1.0 mL/kg腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧位固定于手术台上，剃毛备皮，消毒，铺无菌洞巾。取正中切口开腹，经胰胆管逆行缓慢加压注入5%牛磺胆酸钠溶液1.0 mL/kg, 保持压力5 min后退出，缝合并逐层关腹。大鼠于造模成功后6 h重新开腹，取腹主动脉血2 mL备用。之后处死大鼠，快速取胰腺组织标本待测。

1.4　指标检测

取2 mL血液样本置于37 ℃中静置20 min后, 4 ℃条件下, 3 000 r/min离心15 min, 分离血清，置于-20 ℃冰箱中保存。采用酶联免疫吸附试验法检测血清IL-6、TNF-α水平，采用碘淀粉比色法检测血清Amy水平，操作严格参考按照试剂盒说明书。分离得到胰腺组织，取部分于-80 ℃冰箱中冻存。检测时用冷生理盐水制备成10%的组织匀浆，4 ℃条件下，10 000 r/min离心15 min, 取上清液，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD、MDA水平，操作严格参考按照试剂盒说明书。另一部分组织10%甲醛液固定，石蜡包埋，苏木精-伊红(H-E)染色，组织切片，光镜下观察其组织病理改变，并按Schmidt法半定量评分标准进行组织病理学评分[5]。此外，取部分石蜡切片，常规脱蜡，梯度水化，采用链霉亲合素-过氧化物酶法检测胰腺细胞NF-κB活性。

1.5　观察指标

观察大鼠血清Amy、IL-6、TNF-α水平，胰腺组织中SOD、MDA水平和NF-κB活性，并观察大鼠胰腺组织病理改变及组织病理学评分。

2结果

2.1　各组大鼠胰腺组织病理改变及组织病理学评分比较

假手术组大鼠胰腺组织未见明显的病理改变，其组织病理学评分最低为(0.31±0.28)分；模型组大鼠胰腺组织可见出血坏死，腺泡细胞水肿，呈孤岛样分布，小叶分隔，其组织病理学评分最高为(6.25±0.61)分；丹参治疗组大鼠胰腺组织病理改变较模型组减轻，胰腺细胞轻度变性水肿，间质血管扩张、充血、小叶间隔增宽，见少量脂肪坏死，其组织病理学评分为(5.12±0.42)分。组织病理学评分，两两组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见图1～3。

图1 假手术组胰腺组织正常,可见胰岛 HE 200倍

图2 模型组胰腺组织可见出血坏死,腺泡细胞水肿,呈孤岛样分布,小叶分隔 HE 200倍

2.2　血清Amy、IL-6、TNF-α水平比较

大鼠血清Amy、IL-6及TNF-α水平比较，丹参治疗组高于假手术组，低于模型组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

图3 丹参治疗组胰腺细胞轻度变性水肿,间质血管扩张、充血、小叶间隔增宽 HE 200倍

表1　3组大鼠血清Amy、IL-6及TNF-α水平比较

与假手术组比较，**P<0.01, 与模型组比较, ##P<0.01。

2.3　胰腺组织中SOD、MDA水平和NF-κB活性比较

大鼠胰腺组织中MDA及NF-κB水平比较，丹参治疗组高于假手术组，低于模型组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。大鼠胰腺组织中SOD水平比较，丹参治疗组低于假手术组，高于模型组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2　3组大鼠胰腺组织中SOD、MDA水平和NF-κB活性比较±s)

与假手术组比较，**P<0.01, 与模型组比较，##P<0.01。

3讨论

AP病程凶险，并发症多、病死率高，其发生机制未完全阐明。目前有关AP早期的病理机制主要包括胰腺胰酶的自我消化、肠源性细菌易位及内毒素血症、胰腺微循环障碍、氧自由基作用和前列腺素平衡失调及钙离子内流等[6]。其中炎症细胞因子、氧自由基、黏附因子、氧自由基、一氧化氮合成酶等活化在其病程的发展中起重要作用[7]。

丹参注射液的主要成分为丹参酮。丹参味苦，性微寒，善入血分，疗诸般血证。丹参注射液具有活血化瘀、通脉养心的功效，广泛用于冠心病、急性心肌梗死、AP等疾病的治疗[8]。现代药理学研究表明，丹参具有抑制血小板凝聚、降低血液黏度，达到改善微循环和血液流变学的作用，同时还具有抑制溶酶体的释放、调控炎性因子、抑制中性粒细胞的趋化作用、抗氧化及钙通道阻滞作用[9]。

研究显示，在AP发病早期，抑制炎症细胞因子的过度释放对控制SIRS及MODS的发生和发展具有重要作用[10-13]。活化的NF-κB能与DNA特定κB位点结合，启动和调节众多参与炎症反应、免疫反应有关基因的转录。IL-6、TNF-α及磷脂酶A、氧化应激代谢产物等均受到NF-κB 的刺激和调控。NF-κB可以通过“扳机样作用”触发炎症递质的“瀑布样级联反应”而使得炎症反应的加重和病情的恶化[11,14-16]。故IL-6、TNF-α、NF-κB是反应AP严重程度的有效指标。郑俊全[4]的研究表明，在AP大鼠造模前应用丹参注射液，能明显降低IL-6、TNF-α水平及NF-κB等因子的水平。石星亮等[17]的报道推测，丹参可能通过抑制NF-κB的表达而抑制炎症反应的加重，但目前尚未明确其确切的分子作用靶点。血清Amy水平的检测用于诊断AP历史已久，临床应用较广。本研究结果显示大鼠血清Amy、IL-6及TNF-α水平，胰腺组织中NF-κB水平，及组织病理学评分比较，丹参治疗组高于假手术组，低于模型组，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。进一步证实，丹参注射液在AP大鼠造模前即给予干预性的治疗，能够显著降低病理损害程度，降低Amy、IL-6、TNF-α及NF-κB水平，改善炎症反应进程，达到预防AP的作用。

氧自由基是AP发病及其并发其他器官损伤的重要原因之一。一项利用MCLA为化学发光探针及高敏感光子计数技术检测AP大鼠的胰腺、肝脏表面的超氧自由基的研究发现，大鼠发生AP后2～3 h内即有氧自由基产生，提示氧自由基参与了AP的病理损害过程[18]。MDA为氧化应激损伤性因子，而SOD为氧化应激的保护性因子，这两项因子的水平能够反映机体内过氧化程度，间接反映细胞损伤的程度[19]。研究[20]表明，丹参注射液可以通过降低AP发生时氧自由基的水平，提高机体对氧自由基的清除能力，以减轻胰腺的病理损害程度。本研究结果显示，大鼠胰腺组织中MDA水平比较，丹参治疗组高于假手术组，低于模型组，且大鼠胰腺组织中SOD水平比较，丹参治疗组低于假手术组，高于模型组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

综上所述，丹参注射液对大鼠AP具有一定的预防作用，可减轻AP的病理损害程度，降低Amy、IL-6、TNF-α及NF-κB水平，清除氧自由基，减轻脂质过氧化反应程度。

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Study on preventive mechanism of Danshen Injection in AP rats

DING Fengzhen1, TANG Keqin2

(1.DepartmentofPharmacy; 2.DepartmentofGastroenterology,ChangzhouTCMHospital,Changzhou,Jiangsu, 213003)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the preventive effect of Danshen (Radix Salviae Miltiorrhizae) Injection in rats with acute pancreatitis (AP) and its influence on the levels of nuclear factor-κB (NF-κB), amylase (Amy), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA). MethodsA total of 36 rats with AP were randomly divided into sham operation group, model group and Danshen treatment group, 12 cases for each group. AP rat models were established. 30 min before model establishment, Danshen Injection was injected to the caudal vein of the rats in Danshen treatment group, while normal saline to that of model group. 6 h before model establishment, arterial blood 2 mL and samples of pancreatic tissues were collected to detect the levels of Amy, IL-6 and TNF-α, etc. ResultsDanshen treatment group was evidently higher in sham operation group but prominently lower than model group in serum levels of Amy, IL-6 and TNF-α and levels of MDA and NF-κB in pancreatic tissues as well as histopathological scores, and there were significant differences (P<0.01). Additionally, Danshen treatment group was markedly lower than sham operation group but notably higher than model group in SOD level in pancreatic tissues of AP rats, and the difference was significant (P<0.01). ConclusionDanshen Injection has certain preventive effect on AP rats, and it can alleviate the pathological damage severity, reduce the levels of Amy, IL-6 and TNF-α, remove free radicals and relieve the severity of lipid peroxidation.

KEYWORDS:Danshen Injection; rat; acute pancreatitis; amylase; nuclear factor-κB; tumor necrosis factor-α

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11522339)

收稿日期:2015-01-20

中图分类号:R 576

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2015)17-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201517001