气体冲击处理对草莓活性氧代谢影响的多变量解析

李丽萍, 张 萌, 何欣萌, 杨宏伟, 张成金

（1.北京工商大学食品学院/北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；2.北京电子科技职业学院，北京 100176）

气体冲击处理对草莓活性氧代谢影响的多变量解析

李丽萍1,2, 张 萌1, 何欣萌1, 杨宏伟1, 张成金1

（1.北京工商大学食品学院/北京市食品风味化学重点实验室，北京 100048；2.北京电子科技职业学院，北京 100176）

探讨了气体冲击处理对草莓活性氧代谢的影响。单因素方差分析显示，常温下臭氧显著抑制了草莓果实腐烂指数和呼吸强度的升高，而在低温下显著抑制了腐烂指数、丙二醛的上升，氮气则抑制了常温下果实腐烂指数和丙二醛的上升，加速了过氧化氢含量的下降。主成分分析结果也表明，臭氧处理有利于草莓的保鲜。偏最小二乘回归分析得出，腐烂指数与呼吸强度、花青素、脂氧合酶活性、超氧化物歧化酶活性呈正相关，与过氧化氢酶活性、羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力呈负相关；过氧化氢与过氧化物酶活性、多酚氧化酶活性呈正相关。通径分析显示，呼吸强度、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、抗坏血酸过氧化物酶活性为草莓腐烂指数的直接作用因子，总酚、还原力、多酶氧化酶活性均对其起负间接作用；谷胱甘肽、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性为过氧化氢的直接作用因子，多酚氧化酶活性、抗坏血酸过氧化物酶活性、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力均为过氧化氢的间接作用因子。

草莓；气体冲击；品质；活性氧

草莓（Fragaria ananassa Duc.）含水量高，组织娇嫩，外皮无保护作用，因而在采收和贮运中易受损伤，极不耐贮藏，严重制约了其运输和销售［1］。目前草莓的保鲜方法有很多，如钙和热预处理［2］、高能电子束辐照［3］、气调包装［4］、植酸处理［5］等。气体冲击处理是一种物理保鲜方法，利用低氧环境可抑制果蔬有氧呼吸、减少糖分等有机物消耗的原理，从而达到保鲜的目的。已有研究报道，利用短时气体冲击处理可有效地提高鳄梨［6］和青苹果［7］的贮藏效果，但对草莓的保鲜少有报道。

活性氧影响果实成熟衰老和品质变化，李英华等［8］探讨了采后正己醇处理对草莓果实活性氧代谢和衰老的影响；郭红莲等［9］以草莓悬浮培养的细胞为对象，研究了壳寡糖处理对活性氧代谢的效应；陈学红等［10］研究了高氧处理对草莓果实采后活性氧代谢和腐烂的影响；彭淼等［11］探讨了钙对干旱胁迫下草莓SOD、CAT、PPO活性的影响。但关于多种气体冲击处理对草莓品质与活性氧代谢的相关性分析，目前未见报道。

目前对果蔬保鲜的研究方法主要有单因素方差分析法［12］、主成分分析法［13］、相关性分析［14］、偏最小二乘法回归［15］、通径分析［16］，然而综合运用这几种统计方法的却极少［17-18］，并且对草莓活性氧代谢的研究未见报道。本研究综合运用单因素方差分析法、主成分分析法、偏最小二乘法回归、通径分析四种统计学方法研究了气体冲击处理对草莓品质和活性氧代谢相关指标的影响及其相关性，以期获得高效的草莓保鲜技术。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

草莓品种为湖北武汉的“法兰地”草莓，采摘24 h内运至北京，选择无伤害、同等成熟度、均匀大小的果实，放置到带孔的塑料保鲜盒中。设计4组处理：对照组（即不做处理），臭氧组（仪器功率为15 W，臭氧质量浓度为3.57 mg/L，常温20℃冲击15 min，密封保存），二氧化碳组（二氧化碳冲击15 min，密封保存）和氮气组（氮气冲击15 min，密封保存）。定期取样分析，取样天数为0，4（20℃），8 d（1℃）。

1.2 试剂

三吡啶三吖嗪（TPTZ）、2，2′-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）、二苯代苦味酰基（DPPH）等均为分析纯，购于Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

TB-214型分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；T25型分散机，德国Ultra-turrax公司；F-80C型制冰机，北京博威兴业科技发展有限公司；Eppendorf 5810R型离心机，德国Eppendorf公司；UV -2450型分光光度计，日本岛津公司。

1.4 实验方法

1.4.1 品质指标测定

腐烂指数按式（1）计算。腐烂指数=（0×a+1×b+2×c）/2/（a+b+c）。（1）其中，a为好果数；b为坏果但未霉变的果数；c为坏果且霉变的果数。

1.4.2 呼吸强度测定

呼吸强度测定参考静置碱液吸收法［19］。

1.4.3 总酚、总黄酮含量测定

总酚含量参照文献［20］的方法测定。总黄酮参照文献［21］的方法进行，以芦丁作标准曲线，样品中总酚含量换算为每克鲜重样品中芦丁的含量（μg/g）。

1.4.4 花青素含量测定

花青素含量测定参照文献［22］的方法。以天竺葵-3-葡萄糖苷作标准曲线，样品的花青素含量换算为每克鲜重样品中天竺葵-3-葡萄糖苷的含量（mg/g）。

1.4.5 谷胱甘肽含量测定

谷胱甘肽（GSH）参照文献［23］的方法测定，并有所改进。

1.4.6 过氧化氢和丙二醛含量测定

过氧化氢的测定参考文献［24］方法，并有所改进，以每克鲜重样品的过氧化氢物质的量表示（μmol/g）。丙二醛（MDA）根据文献［25］的方法测定。

1.4.7 抗氧化能力测定

总抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，FRAP）测定参照文献［26］的方法进行，略有改进，以相应的硫酸亚铁浓度（mmol/L）定义为FRAP值并作为总抗氧化能力的活性单位（U），以每克鲜重样品中含有的活性单位来表示（U·g-1）。ABTS自由基清除能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）参照文献［27］的方法进行，略有改进，以ABTS自由基50%清除率定义为1个活性单位（U），以每克鲜重样品中含有的活性单位来表示（U·g-1）。总还原力的测定参考文献［28］的方法，以每克鲜质量样品中含有的活性单位来表示（U·g-1）。参考文献［29］的方法进行清除DPPH自由基能力的测定，将对DPPH自由基50%清除率定义为1个活性单位（U），以每克鲜重样品中含有的活性单位来表示（U·g-1）。羟自由基清除能力测定采用结晶紫分光光度法［20］，以样品对羟自由基50%清除率定义为1个活性单位（U），清除羟自由基清除能力的单位为U·g-1。采用NBT光还原法测定清除超氧阴离子自由基能力［30］，以每克样品中含有的活性单位来表示（U·g-1）。

1.4.8 活性氧代谢相关酶测定

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性的测定参考文献［31］的方法，以每分钟酶促反应体系吸光度变化1为一个LOX活力单位（U）。过氧化氢酶（catalase，CAT）活性测定参照文献［12］的方法，吸光度变化1为一个CAT活力单位（U）。抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性测定参考文献［32］的方法，并有所改进，以每分钟酶促反应体系吸光度变化1为一个APX活力单位（U）。参照文献［33］的方法测定过氧化物酶活性（POD），吸光度变化0.01为一个POD活力单位（U）。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性的测定参照文献［33］的方法，以每分钟酶促反应体系吸光度变化1为一个PPO活力单位（U）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的测定采用NBT光还原法［30］。酶活性均以U·g-1表示。

1.5 数据处理与分析

采用SPSS统计软件进行单因素方差分析（oneway ANOVA），邓肯氏多重差异比较或t检验，当P＜0.05时，表示差异显著。采用Unscrambler 9.7统计分析软件进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘回归分析（PLSR），采用DPS（v.8.01）软件进行通径分析，数据在进行分析前均先做标准化处理。

2 结果与分析

2.1 单因素方差分析

表1为气体冲击处理对草莓活性氧代谢影响的实验结果。由表1可知，常温贮藏4 d时，草莓果实的腐烂指数和呼吸强度均升高，臭氧和氮气处理均发挥了显著抑制作用。此外，臭氧还抑制了花青素含量上升及总酚、总黄酮下降。与对照相比，臭氧和二氧化碳均抑制了其过氧化氢含量的下降，而氮气和二氧化碳处理则抑制了MDA含量的升高。在常温贮藏4 d后，草莓果实还原力和清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子能力显著下降，臭氧抑制了还原力、DPPH自由基清除能力和超氧阴离子清除能力的下降，不同的是，二氧化碳和氮气抑制了总抗氧化能力和清除ABTS自由基能力的升高。草莓果实活性氧代谢相关酶也呈现出不同的变化，3种气体冲击处理均抑制了LOX、POD活性升高和CAT下降。

低温贮藏期间，臭氧处理也表现出抑制草莓腐烂指数和呼吸强度升高的作用，并且也抑制了花青素含量的上升及总黄酮的下降。虽然气体冲击处理均抑制了MDA积累，但仅臭氧和二氧化碳对过氧化氢减少具有抑制效果。此外，3种气体冲击处理均促进了总抗氧化能力的下降，而抑制了ABTS自由基清除能力、还原力的升高和DPPH自由基、羟自由基清除能力的下降。对于活性氧代谢相关酶，3种气体冲击处理均抑制了LOX、PPO、CAT和SOD活性的下降。

2.2 主成分分析

通过主成分分析得到前3个主成分的累计贡献率为77%，因此设定这3个主成分即能够代表整体数据的信息特征。图1是各个理化指标在不同贮藏时间、不同处理下的载荷和得分散点的PCA双标图。

表1 气体冲击处理对草莓活性氧代谢的影响Tab.1 Influence of different treatments on reactive oxygen metabolism in strawberries during postharvest storage

图1（a）中的PC1、PC2分别解释了变量的39%、26%。花青素、POD、总抗氧化能力、MDA、ABTS自由基清除能力、总黄酮在PC1的正坐标处有较高的载荷，羟自由基清除能力、APX、CAT在PC1的负坐标处有较高的载荷；腐烂指数、呼吸强度、LOX、SOD在PC2的正坐标处有较高的载荷，而超氧阴离子清除能力、GSH、DPPH、PPO、还原力、总酚在PC2的负坐标处有较高的载荷。PC1较好地区分了对照与各处理间的样本差异，PC2较好地区分了0 d与常温4 d的样本差异，并且臭氧处理与对照相距较远，说明常温贮藏4 d后草莓果实出现品质劣变，臭氧处理较好地延缓了果实衰老。

图1（b）中的PC3解释了变量的12%。过氧化氢、总黄酮、羟自由基清除能力、POD、PPO在PC3的正坐标上有较高的载荷，腐烂指数、ABTS自由基清除能力在负坐标上有较高的载荷。PC3较好地区分了0 d与低温8 d、对照与臭氧处理之间的差异，说明臭氧处理在低温条件下也对草莓具有保鲜效果。

图1 草莓果实主成分的因子载荷和得分的双标图Fig.1 Loadings and scores from PCA of strawberries

2.3 偏最小二乘回归分析

选取腐烂指数、过氧化氢为因变量，其他指标为自变量，建立PLSR模型图（如图2）。从图2中可以看出，腐烂指数与呼吸强度、LOX、SOD、花青素呈正相关，与羟自由基清除能力、CAT、超氧阴离子清除能力呈负相关；过氧化氢与POD、PPO呈正相关。总酚、总黄酮、还原力、DPPH、总抗氧化能力、MDA、ABTS自由基清除能力、APX、GSH与腐烂指数和过氧化氢有微弱相关性，可见它们对后者的影响较小。

2.4 通径分析

以腐烂指数为因变量、其他指标为自变量做线性回归分析，得到线性回归方程，见式（2）。

X1、X2、X10、X11、X12、X17、X19分别代表呼吸强度、总酚、还原力、DPPH、羟自由基清除能力、APX、PPO。调整决定系数R2=1，并进行显著性检验，F= 42 815.59，p=0.003 7，说明该方程有显著意义，进一步做通径分析。通径分析结果如表2。由简单相关系数值可以看出，腐烂指数与呼吸强度呈极显著正相关，与羟自由基清楚能力呈显著负相关，结合表中作用因子可以看出呼吸强度、总酚、还原力、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、APX、PPO为其直接作用因子，其中呼吸强度和PPO对其为正效应，其他为负效应，除此之外，总酚、还原力、PPO均通过DPPH自由基清除能力对腐烂指数起负间接作用。

图2 基于主成分1与2的PLSR回归模型的相关载荷图Fig.2 Correlation loading plot from PLSR model

表2 以腐烂指数为因变量的通径分析结果Tab.2 Result of path analysis takingrot index as dependent variable

以过氧化氢为因变量、其他指标为自变量做线性回归分析，得到线性回归方程，式（3）。

（X7、X11、X13、X15、X17、X18、X19分别代表GSH、DPPH、NBT、SOD、APX、POD、PPO）。调整决定系数R2= 0.9999，并进行显著性检验，F=8 094.86，p=0.008 6，说明该方程有显著意义，进一步做通径分析。通径分析结果如表3。由简单相关系数值可以看出，POD与过氧化氢的简单相关系数最大为0.628，结合表中作用因子可以看出GSH、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、SOD、APX、POD、PPO为其直接作用因子，其中SSC和蛋白质对其为负效应，其他为正效应，除此，DPPH自由基清除能力、PPO均通过POD对过氧化氢起正间接作用，超氧阴离子清除能力通过GSH对过氧化氢起负间接作用，APX通过SOD对过氧化氢起正间接作用。

表3 以过氧化氢为因变量的通径分析结果Tab.3 Result of path analysis taking H2O2as dependent variable

3 结 论

单因素方差分析显示，常温贮藏4 d时，草莓腐烂指数、呼吸强度、花青素、总酚、MDA、总抗氧化能力、ABTS自由基清除能力、LOX、POD上升，总黄酮、总酚、过氧化氢下降；低温贮藏8 d时与之差异在于总酚上升，总抗氧化能力、POD、LOX下降。常温下臭氧显著抑制了草莓果实腐烂指数和呼吸强度的升高，而在低温下显著抑制了腐烂指数、MDA的上升。主成分结果也显示，臭氧处理有利于草莓的保鲜，这支持了前人的报道［34］。田世平等［35］发现，以氮气做平衡的低氧条件下有利于甜橙的短期保鲜。本研究在草莓果实中得出类似的结论，氮气抑制了常温贮藏时草莓果实腐烂指数和MDA的上升，加速了过氧化氢含量的下降，说明适宜的臭氧处理对草莓具有保鲜效果。但二氧化碳处理加速了呼吸强度的上升，不利于草莓贮藏。

研究表明，活性氧在果实体内的大量积累会导致果实品质的劣变［36］。MDA是膜脂过氧化的产物，具有细胞毒性可导致膜渗漏，使酚类物质与底物接触而发生酶促褐变［37］。偏最小二乘回归分析得出腐烂指数与呼吸强度、花青素、LOX、SOD呈正相关，与羟自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、CAT呈负相关；过氧化氢与POD、PPO呈正相关。通径分析显示，呼吸强度、DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、APX为其直接作用因子，总酚、还原力、PPO均通过DPPH自由基清除能力对腐烂指数起负间接作用。以上结果暗示了呼吸强度和羟自由基清除能力对腐烂指数的影响较大，然而对于气体冲击处理如何影响草莓果实的活性氧代谢，需要进行更深入的研究。

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Multivariate Analysis of Reactive Oxygen Species Metabolism of Strawberry Treated with Gas Impingement

LI Liping1，2， ZHANG Meng1， HE Xinmeng1， YANG Hongwei1， ZHANG Chengjin1
（1.School of Food and Chemical Engineering/Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.Beijing Electronic Science and Technology Institute，Beijing 100176，China）

The effects of individual treatments with gas impingement on fruit quality and reactive oxygen species metabolism of strawberries were analyzed by one-way analysis of variance，principal component analysis（PCA），partial least squares regression（PLSR），and path analysis（PA）.One-way analysis of variance showed that ozone significantly inhibited the strawberry fruit rot index and respiration intensity at room temperature，while suppressed decay index as well as the methane dicarboxylic aldehyde（MDA）content during storage at 1℃.Nitrogen inhibited the decay index and MDA content of strawberries stored at 20℃.It was supported by PCA results which concluded that the ozone treatment was helpful for strawberries storage.PLSR indicated that decay index was positively correlated with respiration intensity，anthocyanins，LOX，and SOD activity，but negatively correlated with CAT，radical scavenging ability of hydroxyl，and ultra oxygen anion.Hydrogen peroxide was positively correlated with POD and PPO.It was showed by PA that respiratory intensity，DPPH radical scavenging ability，hydroxyl radical scavenging ability，and APX were all direct factors for strawberry decay index，while total phenol，reducing power and PPO had negative indirect effects on decay index.GSH，SOD and POD directly impacted hydrogen peroxide of strawberry fruits，but PPO，APX，DPPH radical scavenging ability，and ultra oxygen anion removal ability were indirect factors of hydrogen peroxide.

strawberry；gas impingement；quality；reactive oxygen species

叶红波）

TS255.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.05.006

2095-6002（2015）05-0031-08

李丽萍，张萌，何欣萌，等.气体冲击处理对草莓活性氧代谢影响的多变量解析［J］.食品科学技术学报，2015，33（5）：31-38.

LI Liping，ZHANG Meng，HE Xinmeng，et al.Multivariate analysis of reactive oxygen species metabolism of strawberry treated with gas impingement［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（5）：31-38.

2015-09-01

北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目（CIT&TCD201504008）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAD16B06）；科技部科研院所技术开发研究专项（2014EG127234）。

李丽萍，女，教授，博士，主要从事食品贮藏与加工方面的研究。