费氏丙酸杆菌在酸奶加工中的应用研究

韩芸娇, 邱雯雯, 查梦吟, 陈存社

（北京工商大学食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048）

费氏丙酸杆菌在酸奶加工中的应用研究

韩芸娇, 邱雯雯, 查梦吟, 陈存社*

（北京工商大学食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048）

研究了费氏丙酸杆菌在酸奶发酵过程中和贮藏期的酸度、黏度、脱水收缩率以及后酸化等指标的变化情况。研究结果表明，由费氏丙酸杆菌发酵得到的发酵乳的发酵周期长，需24 h左右，黏度低，脱水收缩率高，口感欠佳，但共轭亚油酸质量浓度较高，达到119.16 mg/L。将费氏丙酸杆菌发酵的酸奶在4℃下贮藏20 d后，酸度增加了约6°T，后酸化能力弱，有利于酸奶的贮藏；贮藏结束时，酸奶中共轭亚油酸（CLA）的质量浓度为117.37 mg/L，仍然处于较高水平。发酵周期长和黏度低等缺点可能会限制费氏丙酸杆菌在酸奶发酵中的应用。

丙酸杆菌；发酵酸奶；共轭亚油酸

目前，我国酸奶产业发展迅速，市面上酸奶的种类琳琅满目，但应用于酸奶发酵的益生菌种还仅仅局限于乳酸菌。酸奶产业需要长远发展，所以开发新的益生菌已是形势所需。

丙酸杆菌用于生产奶酪的研究已非常成熟，其代谢产生的丙酸、乙酸、琥珀酸等有机酸赋予奶酪独特的风味，但奶酪的风味不符合我国消费者的口味习惯，所以奶酪没有在我国获得人们的追求和喜爱。除了应用于生产奶酪以外，丙酸杆菌还可以用于发酵酸奶，但是国内外利用丙酸杆菌发酵酸奶的研究还很少。丙酸杆菌属于革兰氏阳性菌，不运动，没有芽孢形成，厌氧或耐氧，形态多样，呈棒状、球形或不规则的形状［1］，在pH值接近于7，温度为30～37℃的条件下生长最好。大部分丙酸杆菌在严格厌氧的条件下生长速度最快，当大量接种时，在暴露于空气的液体培养基深部生长情况良好［1-2］。丙酸杆菌生长所需要的营养物质要求较高，属于化能异养型；维生素、泛酸、生物素是其生长所必需的营养物质。丙酸杆菌可以代谢的碳源范围较广，如葡糖糖、乳糖、果糖、纤维素、甘油、蛋白胨、乳酸等，代谢产物主要是丙酸、乙酸和CO2以及少量的甲酸、乳酸、琥珀酸等有机酸［3］。丙酸杆菌可以利用多种工业副产品作为能量来源，如玉米浆、蒸馏废液、乳清、酪蛋白水解物，这为丙酸杆菌在工业生产中的应用奠定了良好的基础［4］。本实验拟对费氏丙酸杆菌在酸奶加工中的应用进行研究，探讨其在发酵酸奶过程中以及在贮藏期中各项理化指标的变化情况，总结费氏丙酸杆菌发酵酸奶的特点，并以此评价其用于酸奶加工中的可能性，旨在为酸奶生产提供一种新的益生菌，为后续丙酸杆菌应用于乳品加工提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

直投式费氏丙酸杆菌发酵剂，实验室自制；菌株CICC10019，购自中国工业微生物菌种保藏中心；

直投式乳酸菌发酵剂，发酵剂中包括保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，安琪酵母股份有限公司；

伊利纯牛奶；伊利原味酸奶（市售A）、蒙牛原味酸奶（市售B）；氯仿、盐酸、无水硫酸钠、共轭亚油酸（CLA）标品、甲醇、氢氧化钾，均为分析纯；正己烷，色谱纯。

1.2 实验仪器

LS-B35L-Ⅲ型立式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；LRH-250型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；高速离心机，德国Eppendorf公司；Trace ISQ型气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo Fisher公司；DV-Ⅲ型黏度计，美国Brookfield公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵过程中酸度的测定

将一份直投式费氏丙酸杆菌发酵剂接种于装有50 mL灭菌牛奶的锥形瓶中，30℃发酵24 h。每隔2 h取样，测定发酵乳的酸度，酸度的测定方法参照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》进行。每个时间点做3次平行实验，绘制酸度随时间变化的曲线图。

1.3.2 发酵过程中黏度的测定

将一份直投式费氏丙酸杆菌发酵剂接种于装有50 mL灭菌牛奶的锥形瓶中，30℃发酵24 h。每隔2 h取样，测定发酵乳的黏度，每个时间点做3次平行实验。

黏度的测定方法。黏度计Brookfield-DV-Ⅲ转子（S63），转速100 r/min，等待10 s后读数，读数间隔5 s，每个样品记12个点，计平均值。

1.3.3 脱水收缩率的比较

取10.0 g发酵乳样品，4℃、6 400 r/min，离心10 min，取上清液称重［5］，样品平行测3次，取平均值。并与两种市售酸奶及乳酸菌发酵的酸奶进行比较。脱水收缩率计算公式，见式（1）。

1.3.4 发酵乳中CLA含量的测定

1.3.4.1 样品预处理

脂肪酸的提取。取发酵乳2 mL于圆底离心管中，加入5 mL体积比为2∶1的氯仿-甲醇溶液，漩涡震荡后静置30 min，4℃条件下6 000 r/min离心10 min，用移液枪取出下层有机相置于螺口离心管中。

脂肪酸的甲酯化：脂肪酸甲酯化方法采用酸碱结合法，向脂肪酸提取步骤中得到的有机相中加入2 mL氢氧化钾-甲醇（0.5 mol/mL）溶液，混合均匀，置于65℃水浴中反应30 min，冷却至室温。再加入2 mL盐酸-甲醇溶液（体积分数为10%），70℃水浴5 min。反应结束后冷却至室温，加入5 mL正己烷，震荡后静置，收集有机层，加入无水硫酸钠除水，置于-20℃保存待检测用。

1.3.4.2 气相色谱检测方法

气相色谱检测条件。DB5型色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；升温程序为初始温度150℃，保持3 min，以4℃/min升至202℃，保持10 min，以2℃/min升至206℃，保持3 min，以1℃/min升至207℃，保持1 min，以2℃/min升至209℃，保持1 min；进样口温度250℃；载气（He）流速1.0 mL/min；压力2.4 kPa；进样量1 μL；分流比20∶1；氢火焰离子化检测器FID，燃气为氢气，助燃气为空气。

CLA标准曲线的绘制。称取CLA标准品溶解于甲醇中，按照1.3.4.1的方法进行甲酯化。将CLA甲酯用色谱纯正己烷稀释到不同浓度（0.045～0.360 g/L）。按GC检测条件测定不同浓度标准溶液的峰面积。以CLA浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制CLA标准曲线、得出标准方程，根据标准方程可以求出未知样品的CLA的浓度。

1.3.4.3 发酵乳中CLA含量的测定

将直投式费氏丙酸杆菌发酵剂接种于50 mL灭菌乳中，30℃发酵24 h，发酵结束后按1.3.4.1中的方法对发酵乳进行预处理，使用气相色谱进行检测，3次平行。

1.3.5 贮藏期中pH值与酸度的测定

将直投式费氏丙酸杆菌发酵剂接种于50 mL灭菌乳中，30℃发酵24 h后，放入4℃冰箱中冷藏。测定发酵乳在冷藏0，5，10，15，20 d的酸度与pH值，每组做3次平行实验。

1.3.6 贮藏期中CLA的测定

将一份直投式费氏丙酸杆菌发酵剂接种于50 mL灭菌乳中，30℃发酵24 h后，放入4℃冰箱中冷藏。测定发酵乳在冷藏0，5，10，15，20 d的CLA含量，每组做3次平行实验。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中酸度的变化

费氏丙酸杆菌单独发酵酸奶过程中酸度随发酵时间的变化曲线如图1。从图1中可以看出，酸度随着时间增加而不断增大。酸度变化的趋势与费氏丙酸杆菌的生长规律有关，在发酵初期，费氏丙酸杆菌生长缓慢，产酸速率小，酸度增加缓慢；发酵到6 h以后，费氏丙酸杆菌的生长开始进入对数期，产酸速率加快，酸度的增加也明显变快，到发酵结束时，酸度达到72.0°T。

图1 费氏丙酸杆菌单独发酵酸奶过程中酸度的变化Fig.1 Changes of acidity of propionibacterium freudenreichii fermented yogurt process

一般来说，成品酸奶的酸度需要达到70～110°T，从图1结果中可以看出，费氏丙酸杆菌发酵酸奶需要发酵24 h才能达到酸度的最低要求，这是由费氏丙酸杆菌的生长代谢周期长导致的。在工业生产中，乳酸菌发酵酸奶仅需6 h左右，而费氏丙酸杆菌发酵酸奶的周期则远远长于乳酸菌，这在很大程度上会限制费氏丙酸杆菌在酸奶发酵中的应用。

2.2 发酵过程中黏度的变化

在酸奶发酵的过程中，由于乳酸菌产生的一些胞外多糖以及牛奶体系中pH值的降低，会导致牛奶的黏度逐渐增大，从而赋予酸奶黏稠醇厚的口感［6］。利用费氏丙酸杆菌发酵酸奶，每隔2 h测定发酵乳黏度，黏度随时间变化的曲线如图2。从图2中可以看出，随着时间的增加，黏度呈现出先增大，然后保持不变，最后逐渐下降的趋势。费氏丙酸杆菌发酵酸奶的黏度很低，在最高时只有780.95 cp，这可能是由于费氏丙酸杆菌生长周期长，代谢缓慢，在短时间内不能产生足够的胞外多糖，所以导致发酵乳的黏度较低；另一方面，费氏丙酸杆菌发酵的酸奶在发酵结束时的酸度也会影响酸奶凝胶体系的形成。在发酵后期，黏度出现了下降的趋势，可能是因为费氏丙酸杆菌在代谢过程中产生了水以及乳清析出，导致黏度下降。黏度是影响酸奶口感的一个重要因素，费氏丙酸杆菌发酵的酸奶的黏度较低，这可能会导致酸奶的口感欠佳。

2.3 脱水收缩率的比较

脱水收缩率也是反映酸奶品质的一个重要指标，实验测定并对比了费氏丙酸杆菌与乳酸菌发酵的酸奶以及两种市售酸奶的脱水收缩率，结果如图3。

图2 费氏丙酸杆菌单独发酵酸奶过程中黏度的变化Fig.2 Changes of viscosity of propionibacterium freudenreichii fermented yogurt

图3 脱水收缩率的比较Fig.3 Comparison of syneresis rate

从图3中可以看出，费氏丙酸杆菌发酵酸奶的脱水收缩率最高，其次是乳酸菌，两种市售酸奶的脱水收缩率较低。酸奶是一个凝胶体系，脱水收缩率的大小可以体现酸奶的稳定性，脱水收缩率小，说明酸奶凝胶体系稳定，持水性好，乳清不易析出。费氏丙酸杆菌发酵酸奶的脱水收缩率高，可能是由其产生的胞外多糖少导致的。胞外多糖具有乳化和增加黏度的作用，可以提高酸奶的持水性和稳定性，改善酸奶的质地和口感。在实验过程中也发现，费氏丙酸杆菌发酵的酸奶容易出现乳清析出的现象。此外，市售酸奶中会添加一些稳定剂和增稠剂，这也在一定程度上降低了脱水收缩率。

2.4 发酵乳中CLA含量的测定

图4为CLA的标准曲线图，对不同质量浓度的CLA标准品进行气相色谱检测，得出对应的峰面积，做质量浓度-峰面积的标准曲线图。线性回归方程为：y=0.121 7x+1.393 3，R2=0.999 1，说明在45～360 mg/L质量浓度时，浓度与峰面积线性关系良好，可以根据峰面积求出样品中CLA的质量浓度。

图4 CLA标准曲线Fig.4 Standard curve of CLA

图5是CLA标品的气相色谱图，标品在保留时间为20.74 min和21.01 min处出现一个双峰。

图5 CLA标品的气相色谱图Fig.5 Gas chromatogram of CLA

利用气相色谱法检测发酵好的酸奶中CLA的含量，发酵乳的气相色谱图见图6。发酵乳在保留时间为20.74 min和21.79 min处出现一个双峰，与标品的出峰时间基本一致，并在质谱库中比对确认是CLA。根据峰面积，利用标准曲线求得费氏丙酸杆菌发酵的酸奶中CLA的含量达到119.16 mg/L，处于一个较高的水平。

2.5 发酵乳在贮藏期中酸度的变化

4℃条件下贮藏期间酸度的变化如图7。从图7中可以看出，在贮藏期中酸度增加的幅度不大。在贮藏期前10 d酸度快速增加；贮藏10 d以后，酸度增加缓慢，到贮藏末期，酸度基本保持不变。

图6 发酵乳的气相色谱图Fig.6 Gas chromatogram of propionibacterium freudenreichii fermented yogurt

图7 发酵乳在贮藏期中酸度的变化Fig.7 Changes of acidity during storage period

优良的发酵菌株需要具备后酸化能力弱的特点，如果酸奶的后酸化现象严重，贮藏期中酸度大幅增加，会使酸奶的品质大大下降。一般要求在冷藏条件下贮藏3周后，酸度增加的幅度在7.5～10.0°T［7］，从图7中可以看出，费氏丙酸杆菌发酵的酸奶在4℃下贮藏20 d之后，酸度从70.1°T增加到76.0°T，增加了约6°T，说明费氏丙酸杆菌的后酸化能力弱，于酸奶的贮藏有利。

2.6 发酵乳在贮藏期中CLA含量的变化

图8 发酵乳在贮藏期中CLA含量的变化Fig.8 Changes of CLA concent during storage period

于4℃条件下冷藏期间发酵乳CLA含量的变化如图8。从图8中可以看出，CLA含量在整个贮藏期中呈现出先增加后减少的趋势。在贮藏期的0～10 d，CLA含量缓慢增加，可能是因为，在贮藏初期，费氏丙酸杆菌生长代谢缓慢，使CLA含量有小幅度上升；当贮藏天数达到10 d以后，CLA含量开始减少，这是由于到贮藏后期菌体的生长代谢趋于停止，活菌数也开始减少，CLA不再积累，同时，由于CLA（共轭亚油酸）不稳定，会被氧化生成其他饱和的脂肪酸，最终导致含量逐渐减少。在贮藏结束时，酸奶中CLA的含量为117.37 mg/L，仍然处于一个较高的水平。

3 结 论

实验表明，费氏丙酸杆菌发酵酸奶的特点：1）发酵周期长，需要发酵24 h左右；2）发酵的酸奶黏度低，脱水收缩率高，使酸奶的口感欠佳；3）发酵的酸奶中含有CLA，质量浓度为119.16 mg/L，处于一个较高的水平，并且在贮藏过程中CLA不会有很大的损失，通过初步感官评价，发现费氏丙酸杆菌发酵的酸奶在风味方面与传统酸奶有较大差别，需要进一步分析；4）费氏丙酸杆菌的后酸化能力弱，有利于酸奶的贮藏。费氏丙酸杆菌酸奶的发酵周期长，黏度低，脱水收缩率高等特点可能会限制费氏丙酸杆菌在酸奶发酵中的应用。

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［3］贾彩凤.丙酸杆菌代谢物作为食品防腐剂的研究［D］.上海：华东师范大学.2005.

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Study on Application of Propionibacterium Freudenreichii in Yogurt Processing

HAN Yunjiao， QIU Wenwen， ZHA Mengyin， CHEN Cunshe*
（Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Changes of acidity，viscosity，syneresis rate，and after-acid capacity of Propionibacterium freudenreichii fermented yogurt during the fermentation and the storage period were researched in this study.The results showed that the fermentation period was about 24 h and the yogurt had the lower viscosity，higher syneresis rate，and higher conjugated linoleic acid（CLA）content（119.16 mg/L）.After stored at 4℃for 20 days，the acidity of yogurt increased about 6°T and the weak after-acid capacity of yogurt was benefit to the storage of yogurt.After storage，the CLA content of yogurt was about 117.37 mg/L.However，the long fermentation period and low viscosity might be the limits of application of Propionibacterium freudenreichii in yogurt.

Propionibacterium freudenreichii；yogurt fermentation；conjugated linoleic acid

叶红波）

TS201.3；TS252.54

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.05.008

2095-6002（2015）05-0047-05

韩芸娇，邱雯雯，查梦吟，等.费氏丙酸杆菌在酸奶加工中的应用研究［J］.食品科学技术学报，2015，33（5）：47-51.

HAN Yunjiao，QIU Wenwen，ZHA Mengyin，et al.Study on application of Propionibacterium Freudenreichii in yogurt processing［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（5）：47-51.

2014-12-03

北京市教委科技发展计划项目（KZ20110011013）；北京市自然科学基金资助项目。作者简介：韩芸娇，女，硕士研究生，研究方向为食品微生物；*陈存社，男，教授，博士，主要从事食品微生物发酵等方面的研究。通信作者。