绿原酸调节肥胖大鼠胰岛素抵抗作用的研究＊

杨 辉，周远大，何海霞

（重庆医科大学附属第一医院：1.药学部；2.临床药理研究室 400016）

胰岛素抵抗（IR）在2型糖尿病和心血管病的发病机制中起到重要作用，改善IR 是2型糖尿病患者治疗的一个主要目标［1］。肥胖和缺乏锻炼是IR 的主要原因，减体质量和生活方式改变是IR 治疗的基石和最有效的治疗方法［2］。现有的针对IR 的药物如二甲双胍、噻唑烷二酮类，并不能保持血糖在正常范围内且有显著的不良反应。从天然药物中寻找能改善IR 的药物，逐渐成为研究重点。新近研究发现，中药金银花在抗氧化、降脂降糖［3-5］方面有独到之处，而金银花中最重要的活性物质是3-O-咖啡酰奎尼酸，简称绿原酸（chlorogenieacids，CHA）。本实验拟采用饲喂高脂饲料的方法建立肥胖大鼠IR模型，从生理生化等多方面观察CHA 的作用，旨在为研究CHA 改善IR 作用及其机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级SD 大鼠，雄性，5～6周龄，体质量160～180g，购于重庆医科大学试验动物中心［动物生产许可证号：SCXF（渝）2007-0001］。大鼠由专人标准化饲养房饲养，室内温度保持25 ℃左右，湿度50%左右，明暗周期12h，自由饮水和进食（饲以普通饲料）。适应性喂养1周后进行分组饲养。

1.2 材料与试剂 大鼠基础饲料由重庆医科大学试验动物中心提供；高脂饲料由课题组自制：即在基础饲料中添加10%的蔗糖、2.5%的胆固醇、12%的熟猪油、1%的胆酸盐，总热量为3.867kcal／g，金银花提取物（含98.19% CHA）购自西安开来生物工程有限公司，批号K130224；吡格列酮购自北京太洋药业有限公司，批号120902。胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、游离脂肪酸（FFA）、肌糖原及肝糖原测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；胰岛素放射免疫试剂盒由北京北方生物技术研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 营养型肥胖大鼠IR 模型的建立及实验分组 健康大鼠喂以高脂饲料。饲喂6周后，测定大鼠体质量、体长和口服糖耐量。以体质量超过正常组大鼠20%，Lee′s指数增加且口服糖耐量测试（OGTT）降低作为模型成功的标志［6］，未达标大鼠弃用。以健康大鼠（喂以基础饲料）为空白组，造模成功的大鼠分为模型组、吡格列酮组、CHA 大剂量组、CHA 小剂量组，每组10只。每天上午，CHA 大、小剂量组分别灌服60mg／kg和30mg／kg CHA，吡格列酮组灌服吡格列酮4.5 mg／kg［7-8］（CHA 和吡格列酮均以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配置，现配现用），模型组和空白组灌服羧甲基纤维素钠溶液，各组动物给药容量均为0.5mL／100g。除空白组每天按常规给予基础饲料外，其余实验组给予高脂饲料。实验期间观察大鼠摄食量、饮水量、活动及死亡情况，每周称体质量，连续喂养4周。

1.3.2 Lee′s指数、OGTT 的测定 测定各组大鼠体质量和体长，计算Lee′s指数，Lee′s指数＝体质量（g）×1／3×1 000／体长（cm）。OGTT 方法为大鼠禁食过夜，以葡萄糖水2g／kg灌胃，在0、30、60、120min分别测定血糖，计算血糖曲线下面积（AUC）［9］。

1.3.3 生化指标的测定 用水合氯醛麻醉大鼠，颈动脉插管取血，3 500r／min离心，分离血清，-20 ℃保存待测。用全自动生化分析仪测定大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平，用SOD 和MDA 测试盒测定肝脏组织中SOD 活力和MDA 水平，采用FFA 测试盒测定血清中FFA，大鼠肝糖原、肌糖原的测定用肌糖原及肝糖原测定试剂盒，血清胰岛素水平采用放射免疫方法测定。

1.3.4 脏器系数及体脂比的测定 采血结束后，大鼠断头处死后解剖，取肝脏、肾脏、胰腺和生殖器周围、肾周及肠系膜脂肪，用生理盐水漂净，用滤纸滤干后称质量，计算脏器系数及体脂比。

1.3.5 胰岛素敏感指数（HOMA-ISI）及胰岛抵抗指数（HOMA-IR）的测定 取分离后的血清，测空腹胰岛素（FINS），再结合空腹血糖值（FBG），计算HOMA-ISI＝ln［1／（FBG×FINS）］及HOMA-IR＝（FBG×FINS）／22.5［10］。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据处理，计量数据用±s表示，组间均数比较用单因素方差分析，检验水准α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CHA 对肥胖大鼠体质量及Lee′s指数的影响 由表1可知，造模成功后，模型组，CHA 大、小剂量组，吡格列酮组大鼠体质量组间差异无统计学意义（P＞0.05），但显著高于空白组（P＜0.01）。给予药物干预4 周后，CHA 大剂量组大鼠体质量增长幅度减缓，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。而吡格列酮组大鼠体质量增长幅度与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 CHA 对肥胖大鼠脏器系数及Lee′s指数的影响 由表2可知，与模型组比较，CHA 大剂量组的肝脏系数、肾脏系数和体脂比均有下降的趋势，尤其是肝脏系数和体脂比（P＜0.01）；而吡格列酮组大鼠的肝脏系数、肾脏系数和体脂比与模型组比较没有显著变化（P＞0.05）。造模成功后，模型组，CHA 大、小剂量组，吡格列酮组大鼠的Lee′s指数显著高于空白组（P＜0.01）。给予药物干预4 周后，CHA 大、小剂量组Lee′s指数显著下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）。而吡格列酮组大鼠Lee′s指数与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 CHA 对肥胖大鼠糖耐量的影响 第6周末，从表3中可知，与空白组比较，高脂饲料各组大鼠的1.0h血糖值显著增加（P＜0.01），其余各时间点血糖差异无统计学意义（P＞0.05）；高脂饲料各组的AUC 显著增加（P＜0.05），提示肥胖大鼠的糖耐量降低。第10周末（数据未列出），与空白组大鼠比较，模型组0.5、1.0和2.0h的血糖值显著增加（P＜0.01），AUC显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，CHA 大、小剂量和吡格列酮能够明显降低大鼠口服葡萄糖1.0、2.0h后的血糖水平和AUC（P＜0.01）。表明CHA 和吡格列酮能显著改善糖耐量。

表1 CHA 对肥胖大鼠体质量的影响（±s，g）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，与空白组比较；c：P＜0.05、d：P＜0.01，与模型组比较。

组别 6周 7周 8周 9周 10周空白组 292±52d 327±47d 369±50d 387±51d 405±38 d模型组 402±30b 451±43b 473±43b 491±51b 504±42b CHA大剂量组 400±35b 414±28bc 439±27bc 444±34bc 457±27bd CHA小剂量组 403±41b 432±32b 450±32b 468±42b 484±46b吡格列酮组 401±31b 449±37b 471±38b 485±22b 496±26 b

2.4 CHA 对肥胖大鼠肝糖原、肌糖原、血清胰岛素及抗氧化指标的影响 由表4可知，与空白组大鼠比较，模型组，CHA大、小剂量组，吡格列酮组肝糖原和肌糖原水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，吡格列酮组和CHA 大、小剂量组大鼠肝糖原和肌糖原水平均显著升高（P＜0.01）。模型组大鼠血清胰岛素水平较正常组比较显著上升（P＜0.01），出现高胰岛素血症，表明产生了IR。给予药物干预后，与模型组比较，CHA 大、小剂量组和吡格列酮组大鼠胰岛素水平显著下降（P＜0.01）。表明CHA 和吡格列酮可改善肥胖大鼠的高胰岛素血症。由表4可知，与空白组比较，模型组大鼠肝脏SOD 水平下降，MDA 水平增加；与模型组比较，CHA 大、小剂量组，吡格列酮组大鼠肝脏SOD 水平升高，MDA 水平显著降低，差异有统计学意义（均P＜0.01）。

表2 CHA 对肥胖大鼠脏器系数、体脂比及Lee′s指数的影响（±s）

表2 CHA 对肥胖大鼠脏器系数、体脂比及Lee′s指数的影响（±s）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，与空白组比较；c：P＜0.05、d：P＜0.01，与模型组比较。

组别 肾脏系数 肝脏系数 胰系数 体脂比 Lee′s指数（6周） Lee′s指数（10周）空白组 0.61±0.06d 2.52±0.25d 0.17±0.02d 2.77±0.28d 305.03±20.76c 289.08±10.39 d模型组 0.74±0.10b 3.15±0.31b 21.00±0.03b 5.19±0.52b 333.35±27.67a 316.97±8.99b CHA 大剂量组 0.66±0.06a 2.63±0.27d 0.19±0.02a 4.08±0.42bd 332.52±20.94b 298.12±10.06d CHA 小剂量组 0.72±0.10b 2.92±0.31b 0.21±0.03b 4.76±0.50b 333.84±26.82a 304.83±13.44bc吡格列酮组 0.75±0.13b 3.14±0.53b 0.22±0.04b 5.24±0.87b 336.75±27.94b 313.17±18.85 b

表3 6周末CHA 对肥胖大鼠糖耐量的影响（±s）

表3 6周末CHA 对肥胖大鼠糖耐量的影响（±s）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，与空白组比较。

组别血糖（mmol／L）0min 0.5h 1.0h 2.0h AUC（mm2）空白组 4.37±0.69 6.07±0.69 6.09±0.53 4.30±0.56 10.84±0.99模型组 4.59±0.33 6.15±0.73 7.37±093b 4.64±1.26 12.07±1.29a CHA 大剂量组 4.62±0.39 6.04±0.73 7.46±1.01b 4.59±0.81 12.07±1.01a CHA 小剂量组 4.57±0.34 6.09±0.73 7.38±1.11b 4.71±1.02 12.08±0.85a吡格列酮组 4.79±0.39 6.14±0.82 7.37±1.17b 4.41±0.85 12.00±0.84 a

表4 CHA 对肥胖大鼠肝糖原、肌糖原、血清胰岛素及抗氧化指标的影响（±s）

表4 CHA 对肥胖大鼠肝糖原、肌糖原、血清胰岛素及抗氧化指标的影响（±s）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，与空白组比较；d：P＜0.01，与模型组比较。

组别 肝糖原（mg／g）肌糖原（mg／g）胰岛素（mU／L）SOD活力（U／mgprot）MDA 水平（nmol／mgprot）CAT 活力（U／mL）空白组 11.16±0.78 1.95±0.41 13.81±078 91.10±12.37 3.54±0.87 4.16±1.44模型组 6.19±0.89b 1.25±0.28b 17.49±090b 55.04±7.61b 11.91±3.32b 1.55±0.62b CHA 大剂量组 9.48±1.47bd 1.80±0.34d 12.98±1.47d 88.18±15.16bd 6.27±3.82ad 3.92±0.67d CHA 小剂量组 8.12±0.70bd 1.74±0.29d 13.12±0.70d 70.47±11.31bd 9.10±3.03bd 2.62±1.71a吡格列酮组 9.74±1.40bd 1.81±0.34d 12.74±1.40ad 69.11±12.24bd 6.49±1.54bd 1.83±0.86 d

表5 CHA 对肥胖大鼠血脂水平的影响（±s）

表5 CHA 对肥胖大鼠血脂水平的影响（±s）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，与空白组比较；c：P＜0.05、d：P＜0.01，与模型组比较。

组别 TG（mmol／L） TC（mmol／L） HDL-C（mmol／L） LDL-C（mmol／L） FFA（μmol／L）空白组 1.30±0.14 2.05±0.82 1.06±0.11 0.59±0.63 517.15±205.78模型组 2.28±0.69b 5.11±0.98b 0.97±0.13b 2.65±0.84b 1165.95±231.28b CHA 大剂量组 1.29±0.20d 3.76±1.12bd 1.28±0.19ad 1.38±0.93ad 754.13±187.15ad CHA 小剂量组 1.50±0.16ad 4.01±1.11ad 1.15±0.11d 1.28±0.84d 861.56±364.98ac吡格列酮组 1.37±0.10d 2.64±0.57d 1.21±0.11ad 0.70±0.43d 756.76±188.20 ad

2.5 CHA 对肥胖大鼠血脂水平的影响 由表5可知，与空白组比较，模型组大鼠血清TG、TC、HLD 和FFA 水平显著升高（P＜0.01），HDL水平则显著降低（P＜0.01）。给予药物干预后，CHA 大、小剂量，吡格列酮组TG、TC、HLD 和FFA 水平均有不同程度地降低（P＜0.05或P＜0.01），HDL 水平均有不同程度的升高（P＜0.01）。

2.6 CHA 对肥胖大鼠HOMA-IR和HOMA-ISI影响 由表6可知，实验结束时与空白组比较，模型组HOMA-IR 增加，HOMA-ISI下降，差异均有统计学意义（P＜0.01）。CHA 大、小剂量组、吡格列酮组与模型组比较，HOMA-IR 明显下降，HOMA-ISI增加，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表6 CHA 对肥胖大鼠HOMA-ISI和HOMA-IR 的影响（±s）

表6 CHA 对肥胖大鼠HOMA-ISI和HOMA-IR 的影响（±s）

b：P＜0.01，与空白组比较；d：P＜0.01，与模型组比较。

组别HOMA-ISI HOMA-IR空白组 -（1.09±0.10）2.87±0.27模型组 -（1.26±0.04）b 3.88±0.51b CHA 大剂量组 -（1.01±0.18）d 2.71±0.25d CHA 小剂量组 -（1.03±0.10）d 2.72±0.24d吡格列酮组 -（0.97±0.14）d 2.72±0.39 d

3 讨 论

IR是2型糖尿病和心血管疾病的共同发病基础，改善IR是2型糖尿病患者治疗的一个主要目标。肥胖和缺乏锻炼是IR的主要原因，减体质量和改变生活方式是IR 治疗的基石和最有效的治疗方法。Lee′s指数与腹腔脂肪湿质量、脂肪细胞及血脂等指标高度相关，可作为评价成年肥胖模型大鼠肥胖程度的指标。肥胖往往伴有体内脂肪组织聚集和高脂血症，特别是血清FFA 的增高在IR 的发病过程中发挥重要作用［11-12］。FFA 与IR 互为因果，互相促进。肥胖（尤其是腹型肥胖）机体，其脂肪分解活跃，脂肪细胞的FFA 释放增多，导致高FFA血症，进而产生IR［13］。本实验采用高脂饲料喂养6周制备肥胖大鼠IR 模型，再继续给予高脂饮食的情况下给予药物干预4周，实验结果表明CHA 可显著降低Lee′s指数、脏器指数及体脂比，减肥效果优于吡格列酮。同时，CHA 可降低高脂诱导的大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA 水平，提高HDL-C 水平，表明CHA 改善胰岛素抵抗的作用可能与减体质量降脂有关。

研究发现，肥胖与自由基损伤有着密切的关系［14］。SOD和CAT 是机体自由基清除酶，MDA 是脂质过氧化产物。实验结果表明CHA 可明显增加肝脏SOD 水平和血清CAT 水平，降低肝脏中MDA 水平，其中CHA 大剂量组效果最为显著，表明CHA 改善肥胖大鼠IR 的作用可能与降低氧化应激，防止脂质过氧化有关。胰岛素调节血糖作用的主要靶器官是肝脏、骨骼肌和脂肪组织。IR 状态下，内源性葡萄糖的增多，肝脏和骨骼肌糖原储存减少。实验结果表明，CHA 能显著增加糖耐量，降低血清胰岛素水平，增加肝糖原、肌糖原的水平，降低HOMA-IR，升高HOMA-ISI。

本研究结果显示CHA 具有良好的抑制内脏脂肪聚积和改善胰岛素抵抗的作用，并能促进外周组织吸收利用葡萄糖，降低血清FFA 水平，降低肥胖大鼠的氧化应激，防止脂质过氧化，其分子机制值得进一步研究。

［1］ Smyth S，Heron A.Diabetes and obesity：the twin epidemics［J］.Nature Medicine，2006，12（1）：75-80.

［2］ Altaf Q，Barnett AH，Tahrani AA，et al.Novel therapeutics for type 2 diabetes：insulin resistance［J］.Diabetes Obes Metab，2015，17（4）：319-334.

［3］ Karthikesan K，Pari L，Menon VP.Combined treatment of tetrahydrocurcumin and chlorogenic acid exerts potential antihyperglycemic effect on streptozotocin-nicotinamideinduced diabetic rats［J］.Gen Physiol Biophys，2010，29（1）：23-30

［4］ Pari L，Karthikesan K，Menon VP.Comparative and combined effect of chlorogenic acid and tetrahydrocurcumin on antioxidant disparities in chemical induced experimental diabetes［J］.Mol Cell Biochem，341（1／2）：109-117.

［5］ 王强，陈东辉，邓文龙.金银花提取物对血脂与血糖的影响［J］.中药药理与临床，2007，23（3）：40-42

［6］ 祝莹，董英，钱希文，等.苦瓜冻干超微粉调节肥胖大鼠胰岛素抵抗及其作用机制研究［J］.中国食品学报，2014，14（7）：5-13.

［7］ Lee YS，Kim WS，Kim KH，et al.Berberine，a natural plant product，activates AMP-activated protein kinase with beneficial metabolic effects in diabetic and insulinresistant states［J］.Diabetes，2006，55（8）：2256-2264.

［8］ 李延兵，廖志红，黄知敏，等.吡格列酮和二甲双胍对2型糖尿病胰岛素抵抗的影响［J］.中国内分泌代谢杂志，2004，20（1）：30-32.

［9］ 陈清光，陆灏，李俊燕，等.健脾清化方对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗的影响［J］.中华中医药杂志，2014，29（10）：3239-3242.

［10］ Rong X，Li Y，Ebihara K，et al.Angiotensin Ⅱtype 1receptor-independent beneficial effects of telmisartan on dietary-induced obesity，insulin resistance and fatty liver in mice［J］.Diabetologia，2010，53（8）：1727-1731.

［11］ Savage DB，Petersen KF，Shulman GI.Disordered lipid metabolism and the pathogenesis of insulin resistance［J］.Physiological Reviews，2007，87（2）：，507-520.

［12］ Lee YS，Cha BY，Saito K，et al.Effects of a Citrus depressa Hayata（shiikuwasa）extract on obesity in high-fat diet-induced obese mice［J］.Phytomedicine，2011，18（8／9）：648-654.

［13］ 李佳，徐玲，蒋岚.血脂异常对胰岛β细胞功能和胰岛素敏感性的影响［J］.重庆医学，2010，39（17）：2264-2269.

［14］ 罗蓉，瞿颂义.肥胖与自由基［J］.国外医学：内分泌学分册，2004，24（B5）：9-10.