DNA 去甲基化酶TET2在胃癌细胞低表达与肿瘤转移的相关性

郭 严，雷增杰，王 斌，陈东风

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所消化内科，重庆400042）

胃癌是临床常见恶性肿瘤之一，其侵袭转移性强，发病率和死亡率居我国第2位［1］。肿瘤进展伴随基因组异常甲基化改变，新近发现DNA 去甲基化酶TET（ten eleven translocation）蛋白家族调控DNA 主动去甲基化，可能调控肿瘤进展。血液系统肿瘤中存在TET 蛋白家族成员TET2（ten eleven translocation 2）基因突变［2-4］，乳腺癌等实体肿瘤中TET2 蛋白催化产物5hmC丰度降低［5］，表明TET2可能在肿瘤进展中发挥重要作用。上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是肿瘤细胞浸润转移的关键始动步骤。EMT 导致上皮细胞极性消失，E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-cad）表达降低，细胞间黏附减退，呈现成纤维细胞样表型，侵袭和运动能力增强，但目前尚不清楚TET2是否参与EMT，是否与肿瘤细胞转移特性相关。本研究检测TET2在胃癌组织中的表达情况，分析其表达及与EMT标志物E-cad表达的相关性，分析TET2与肿瘤转移的关系，探讨TET2在胃癌侵袭转移中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2001年2月至2005年12月本院行手术切除的胃癌标本168 例。所有患者术后存活时间为6～143 个月，中位生存期为57.2个月。以发现胃癌后第1次手术时间为基线，分别进行电话及信件随访患者的生存状态、用药或化疗情况、检查结果、康复情况、肿瘤复发时间等。选取随访资料完整病例100例，其中男73例，女27例；年龄31～78岁，中位年龄58.7岁。肿瘤直径小于或等于5cm 的有75例，大于5 cm 的有25例。按国际抗癌联盟（UICC）的TNM 标准，Ⅰ期23例，Ⅱ期41例，Ⅲ期36例（表1）。患者术前未实施辅助化疗及放疗。

1.2 方法 手术切除胃癌组织标本，10%甲醛固定，石蜡包埋，制成组织芯片。5μm 连续切片4张，2张用于免疫组化SP法分别检测TET2、E-cad，1张HE 染色，1张用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。兔抗人TET2单克隆抗体购自美国Abcam 公司，兔抗人E-cad单克隆抗体、PV-6000染色试剂盒、DAB酶底物染色剂等均购自北京中杉生物技术有限公司。光学显微镜下采用二级计分法结果判断。（1）阳性细胞百分率计分：随机选择5个视野（×200），计算阳性细胞百分比，无阳性细胞为0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分。（2）染色强度计分：阳性颗粒为淡黄色计1分，黄色或深黄色计2分，黄褐色计3分。1、2项评分相乘，≥3分者为高表达，＜3分者为低表达。

1.3 统计学处理 使用SPSS 17.0软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验，两种蛋白之间的相关性采用Spearman等级相关分析，总体生存率用Kaplan-Meier方法计算，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌组织低表达TET2、E-cad蛋白 TET2主要表达在细胞核，在29例癌旁组织中高表达21例（82.8%），在胃癌组织中表达下降或缺失，在100例胃癌组织中高表达仅有24例，占24.0%（图1A、B），差异有统计学意义（P＜0.05）。E-cad主要表达在细胞膜，在癌旁组织中高表达率为65.5%（19／29），在胃癌组织中高表达率为26.0%（26／100）（图1C、D），差异有统计学意义（P＜0.05）。这些数据提示，TET2、E-cad在胃癌组织中表达下降。

2.2 肿瘤细胞TET2、E-cad表达丰度与胃癌临床病理特征密切相关 TET2在不同性别、年龄的胃癌组织中的表达无明显差异（P＞0.05），而与肿瘤直径、分化、淋巴结转移、TNM 分期的表达有统计学意义（P＜0.05）。肿瘤直径大于5cm 的胃癌组织，TET2表达比肿瘤直径小于5cm 的胃癌组织明显下降（P＜0.05）。随着肿瘤分化程度的下降，TET2表达降低，低分化胃癌患者中，TET2表达存在不同程度的缺失。TNM Ⅲ期和淋巴结转移的胃癌组织中TET2 表达率明显下降（表1）。E-cad在不同年龄、性别、不同直径的胃癌组织中的表达差异无统计学意义（P＞0.05），但在低分化、TNM Ⅲ期、淋巴结转移的胃癌组织中E-cad表达率明显下降（P＜0.05），见表2。

图1 免疫组化检测TET2、E-cad在胃癌及癌旁组织中的表达（SABC×200）

表1 TET2、E-cad的表达与胃癌临床病理特征的关系［n（%）］

2.3 胃癌细胞低表达TET2、E-cad与胃癌不良预后相关 进一步分析TET2、E-cad 的表达与胃癌预后的关系，Kaplan-Meier分析的结果显示：胃癌组织中TET2、E-cad的高表达组总生存率均高于其低表达组（P＜0.05），见图2A～C。分析TET2与胃癌临床病理特征之间的关系发现，TET2与胃癌淋巴结转移相关，其表达均有统计学意义（P＜0.05），推测TET2表达可能参与胃癌的转移。所以，进一步运用Kaplan-Meier观察TET2表达与胃癌无转移生存率之间的关系。分析发现胃癌组织中TET2、E-cad的高表达组无转移生存率高于其低表达组（P＜0.05），见图2D。COX 比例风险模型多因素分析（表2）提示TNM 分期、TET2 可以作为独立预后因素（P＜0.05），而年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤分化以及E-cad表达不是独立的预后因素（P＞0.05）。

图2 TET2、E-cad表达在胃癌患者中的生存曲线

表2 胃癌各临床因素与总生存率的多因素分析

2.4 胃癌组织中TET2与E-cad蛋白表达水平呈显著正相关性 Spearman等级相关分析各因素间的相关性，如表3所示：在TET2低表达的胃癌组织中，E-cad低表达为90.5%（67／74），E-cad高表达为9.5%（7／74）。在TET2高表达的胃癌组织中，E-cad高表达为65.4%（17／24），E-cad低表达为34.6%（9／24）。二者呈显著正相关（r＝0.574，P＜0.01）。这些结果提示TET2丢失与胃癌细胞EMT 可能存在密切关系。

表3 TET2与E-cad在胃癌表达中的相关性分析

3 讨 论

DNA 的胞嘧啶5-甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，它在生物发育和基因调节中发挥着重要的作用［6］。研究表明，DNA 胞嘧啶甲基化在特定位点生成的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mc）可经DNA 去甲基化酶TET 蛋白羟化后生成5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmc）。TET 蛋白家族有3位成员，分别是TET1、TET2、TET3［7］。另外，TET蛋白还可以氧化5mc或5hmc，从而将其转化为5-甲酰胞嘧啶（5-formylcytosine，5fc）和（或）5-羟基胞嘧啶（5-carboxylcytosine，5caC）［8］。这说明TET 蛋白家族成员通过修饰DNA 甲基化参与生物的生长及发育。

近年来，TET2在肿瘤发生过程中的作用成为研究热点。TET2在骨髓增生异常综合征、红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化、母细胞性浆细胞样树突细胞瘤中发生突变［3-4］。Yang等［5］发现，TET2在其他上皮来源性肿瘤，如：乳腺癌、肝癌中的表达都较正常组织降低。在本实验中，与癌旁组织相比，TET2 在胃癌中表达下降或缺失，高表达率仅为24%（24／100）（P＜0.05），其表达与胃癌大小（P＝0.033）、分化（P＝0.003）、淋巴结转移（P＝0.001）及TNM 分期（P＝0.034）之间存在着显著统计学关联，进一步证实了TET2蛋白参与了胃癌的发生、发展，并可能与胃癌的增殖、侵袭和转移有关。

本实验研究还表明，E-cad在胃癌中表达下调，而E-cad的下调是EMT 的重要生物学特征。大量研究表明，EMT 是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。E-cad阴性细胞的运动能力明显增强，从而导致肿瘤侵袭、转移。本研究发现，E-cad在胃癌组织中的表达较正常胃黏膜显著下降，并在低分化、TNM Ⅲ期和有淋巴结转移的胃癌患者中表达下降或缺失（P＜0.05），与既往在其他肿瘤中的研究报道一致。

进一步分析TET2与EMT 关键指标E-cad相关性，作者发现，TET2与E-cad在胃癌组织中的表达呈显著正相关（P＜0.001）。Su等［9］研究发现，敲除正常乳腺上皮细胞株MCF-10A 中的TET2基因可以促使EMT 发生，说明TET2可以通过下调E-cad的方式进一步促进胃癌的转移能力。而TET2与E-cad之间可能存在着密切关系，其发生机制可能是TET2突变影响H3K9去甲基化，从而调控Wnt／β-catenin信号通路，促进细胞增殖，抑制凋亡，诱导EMT 发生［10-11］。

本研究显示TET2和E-cad的低表达与患者生存率下降有关（P＜0.05），其低表达患者无转移生存率更低（P＜0.05），多因素分析也证实TET2可以作为胃癌的独立预后指标，提示TET2蛋白是胃癌预后的重要影响因子之一。

综上所述，TET2在低分化、TNM Ⅲ期、有淋巴结转移的胃癌组织中的表达率明显降低，其低表达预示着淋巴结转移及更差的预后。TET2与EMT 重要因子E-cad之间存在着显著正相关，说明其共同参与了胃癌的侵袭和转移。TET2这一新的肿瘤相关因子，可作为胃癌预后判断的评价因素，还可能为胃癌的治疗提供新的靶点。但是，TET2如何调控EMT 参与肿瘤侵袭转移的分子机制尚不明确，也是下一步研究的重点。

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